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pcDNA3.1+の近接サイトのダブル消化 トピック削除
No.7061-TOPIC - 2018/07/09 (月) 03:08:16 - M1
pcDNA3.1+の近接サイトのダブル消化について不安があります。
まだ試したことがないのですが、不安に思ったので質問させてください。

pcDNA3.1+のNot1とXho1は同時に消化することは可能でしょうか？
あるいは一つ一つ消化したとしても、端に十分の塩基があったほうが消化は良いと聞きますが、この場合どうでしょうか？
　
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No.7061-10 - 2018/07/09 (月) 22:09:30 - 中年
PvuI(ScaI)-NotIとXhoI-PvuI(ScaI)とinsertの3ピースライゲーションをします。CIAP処理が不要、かつPvuIやScaIはAmpR内の酵素なのでバックグラウンドも低いです。

(無題) 削除/引用
No.7061-9 - 2018/07/09 (月) 17:18:15 - 774
どちらかをbluntで。
3.1+ならvectorをEcoRVでインサートのNotIをbluntにするかな。
（フレームの制限があったらごめんなさい）

(無題) 削除/引用
No.7061-8 - 2018/07/09 (月) 16:06:13 - qq
「何としてもXhoI+NotIで切って、入れたいのだ！」
ということであれば、まず、pcDNA3.1のXhoI部位に適当なサイズ（1-2kbpくらいだと楽か？）のXhoI断片（NotIで切断されない）を一旦ライゲーションしてDNAをクローニングします。
そこから、NotI＋XhoIで切断して適当なサイズのベクター側のDNAを拾います。
まあ、少し遠回りですが無理ではない。

(無題) 削除/引用
No.7061-6 - 2018/07/09 (月) 14:01:49 - M1
おおさん、なるほどです。ありがとうございます。

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No.7061-5 - 2018/07/09 (月) 13:13:05 - おお
Notは先にきりたいなぁ。どちらかで切れていればアルフォスでブロックできるから、ある程度両方切れたものがあればLigationはワークするはず。

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No.7061-4 - 2018/07/09 (月) 10:27:18 - M1
みなさん、ありがとうございます。
無理そうですね。特に素人の私には。

ノットワンとザバワンに変更します。ありがとうございました。

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No.7061-3 - 2018/07/09 (月) 09:09:38 - カートン箱
NotIもXhoIも、認識配列＋2塩基以上ないとO/N反応させても切れないみたいですね。XhoIよりもNotIの方が塩基数条件きつめ。

pcDNA3.1+内でNotIとXhoIは隣接しているため、制限酵素同士の立体障害による切断効率低下も考えられるかと思います。

一段階ずつ切断→(失活処理)→バッファ交換としたいところです。
反応液組成が単純なXhoIから切りたいところですが、末端に残る塩基数が短すぎてNotIで切れなくなる恐れがあり、逆にNotIを先にするとBSAとかTritonX100とか余計なものが入る…。
NotIで先に切ってスピンカラム精製し、次にXhoIで切る、位が私の思いつく方法です。

(無題) 削除/引用
No.7061-2 - 2018/07/09 (月) 09:08:45 - xyz
PCR産物末端の制限酵素切断 - Takara
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006082

pcDNA3.1+の近接サイトのダブル消化 削除/引用
No.7061-1 - 2018/07/09 (月) 03:08:16 - M1
pcDNA3.1+の近接サイトのダブル消化について不安があります。
まだ試したことがないのですが、不安に思ったので質問させてください。

pcDNA3.1+のNot1とXho1は同時に消化することは可能でしょうか？
あるいは一つ一つ消化したとしても、端に十分の塩基があったほうが消化は良いと聞きますが、この場合どうでしょうか？
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