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(無題) 削除/引用 No.7054-12 - 2018/07/07 (土) 12:42:29 - おお たぶん次の質問はこれだとおもうので、、、 ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9073365 ttps://www.qiagen.com/au/resources/faq?id=c1e0bb36-c24e-4e08-abd8-9dfcc899ca62&lang=en ttps://www.zymoresearch.com/zymocleantm-gel-rna-recovery-kit

(無題) 削除/引用 No.7054-11 - 2018/07/07 (土) 08:10:44 - おお Ampure XP beadsはちょっと難しそうですね。アガロースなどで電気泳動するのが一番手っ取り早いでしょう。RNAの電気泳動はTAEなどでもできますが、高次構造で泳動パターンが変わることがありますので泳動する前に６０度とかで熱変性、急冷して泳動時間も１５分ぐらいとかで終わらすというような工夫をしたほうがいいでしょう（変性状態を保てるような工夫もあるのですがあまり複雑にしすぎてもどうかとおもいますので）。 あと使えると思ったのがCHROMA SPIN™-1000ですが、Single strandの使用例が示されてないので使うときに試行錯誤しないといけないかもしれません。同じメカニズムですがGel filteration columnでちゃんとクロマトグラフィーをしてもいいでしょうけど。 アミコンなどのUltrafilterationも使えると思いますが（たぶん１００kぐらいで）、使用例をみつける必要があるのではないかと。 めんどくさいかもしれないですが意外とうまくいくと思えるのがDEAEのクロマトグラフィーです。と書いておきながら、どこまでうまくいくかといわれると、あまりうまく答えられませんけど。 逆転的発想ではPolyAがトラップできるならrRNAに相補なDNAをゲルにつけてやるとrRNAを除くことができるし、GFPのmRNAに相補なDNAをゲルにつけてやると特異的になmRNAが回収はできます。 まあそれぞれの方法論にある程度知識と経験があるならやってみてもいい方法かと思っていますが、そうでないならPolyA精製かアガロースゲルで分けるかでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.7054-10 - 2018/07/07 (土) 01:07:09 - K おお さん、moz さん、ありがとうございます。 ＞まてよ。GFPで２０強kDaだから６００〜７００bくらいじゃないかな。ポリAついたとして１kbとか。１８sで１.８kbぐらい。サイズで分けれそうな気がしてきた。 Ampure XP beads とかで可能だと思われますか？それともゲルで泳動して切り出しとかですか？

(無題) 削除/引用 No.7054-9 - 2018/07/06 (金) 10:40:20 - おお まてよ。GFPで２０強kDaだから６００〜７００bくらいじゃないかな。ポリAついたとして１kbとか。１８sで１.８kbぐらい。サイズで分けれそうな気がしてきた。

(無題) 削除/引用 No.7054-8 - 2018/07/06 (金) 10:10:30 - moz RNAはアルカリ（特にMg存在下）には弱いですが、化学的には丈夫なポリマーです。

(無題) 削除/引用 No.7054-6 - 2018/07/06 (金) 10:07:06 - K ありがとうございます。 >ちょっと確認ですがGFPのmRNAをIn vitroで合成するような系ではあなたの実験には使えないのでしょうか？そういう実験なら結構やられています。 最終的な目的には使えないです。でもポジコンとしてまずやってみるというのはありかもしれません。ただ、最終的には抽出したRNAを使いたいので、合成したRNA で分かるのは、リポフェクションの操作がおかしくないことくらいですね。それで本番に進むというのもありかもしれませんけど。 >オリゴdTから外す高温処理がだめかどうかはプラクティカルにはわかりませんけど、理想的な状況でケミカルにRNAが変化することはないと思います。 RNAって凍結や高温で割れたりキャップが云々といったことは簡単には起こらないと思われるでしょうか？PCRには問題ないのは確かでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.7054-5 - 2018/07/06 (金) 09:50:44 - おお ちょっと確認ですがGFPのmRNAをIn vitroで合成するような系ではあなたの実験には使えないのでしょうか？そういう実験なら結構やられています。 オリゴdTから外す高温処理がだめかどうかはプラクティカルにはわかりませんけど、理想的な状況でケミカルにRNAが変化することはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.7054-4 - 2018/07/06 (金) 09:14:48 - K 返信ありがとうございます。 やはりそう思いますか。 最終的には mRNA と miRNA の混合物と想定されるものをトランスフェクションするつもりですが、ポジコンが動かないと進みがたいので、mRNA の精製を考えようと思います。 mRNAを精製するにはやはりオリゴdTビーズでしょうか。 サイズで分けるみたいのでは、rRNA と (GFP の) mRNA ではサイズが近すぎますよね？ 念のためお聞きしたいのですが、ビーズに付けたり外したりするための高温インキュベーションはトランスフェクションに影響ないと思われますか？

(無題) 削除/引用 No.7054-3 - 2018/07/06 (金) 08:39:55 - moz total RNAの1~2%がmRNAですからね。polyA RNAを調製した方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.7054-2 - 2018/07/06 (金) 08:27:39 - おお 単独のmRNAをTransfectionして発現させることはそんなに変なことではないですし、すでにいろいろな実験がなされていると思います。たとえば、 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/LMRNA003 ただし、単独のmRNAをマイクログラムオーダーで使うので細胞から抽出したTotalRNAで１ｕg使ったとして目的のmRNA量はどうだろう、ピコグラムオーダーでもおかしくないかも（ちょっとアクチンで計算しようと思ったけど暇がなかったので感覚だけでかいてますけど）。mRNAをマイクロインジェクションで導入する方法もありますけど、これも単独でngオーダーじゃないかな。 実験によりますがmRNAを精製するなどの工夫が必要じゃないかなと思います。

組織から抽出したRNAを培養細胞にトランスフェクション 削除/引用 No.7054-1 - 2018/07/06 (金) 07:31:47 - K わけがありまして少しトリッキーなのですが、組織（肝臓）から抽出したRNAを培養細胞にトランスフェクションしようとしています。 雑な実験ですが、ポジコンとして、GFPを大量に強制発現した肝臓から total RNA を抽出し、ラボにある Lipofecatmine3000 で HepG2 にトランスフェクションしようとしました。期待としては、GFP の mRNA が雑多な RNA と一緒にトランスフェクションされ、蛍光が見えると思ったのですが、実際うまくいきませんでした (全く何も光りません)。 肝臓はがっつり緑でしたし、抽出した RNA (トランスフェクションに用いたRNA自体) は電気泳動では良いクオリティに見えます。トランスフェクションに用いる RNA の濃度を上げても全く光りませんでした。 rRNAが邪魔をしているのでしょうか？仮に mRNA が rRNA より圧倒的に少ないせいで GFP の mRNA の濃度が低いにしても、全く見えないものでしょうか。 それとも、抽出した RNA をトランスフェクションに用いること自体、原理的に問題がある思いますか？mRNA のトランスフェクションに詳しい人も周りにいないもので、トラブルシューティングの優先順位も分からず困っています。

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