皆さま、たくさんのアドバイスをありがとうございます。ご提案くださったことを試してみたいと思います。
トラフェ効率をちゃんと確認すべき、というのはボスにも何度か話をしているのですが、抗体がない、タグ付きはタグによる影響があるかもしれないし、その価値がないと遠まわしに言われてしまいましたので、私の考え方がよくないのかと思っていました。おそらくこれまではできる人がいたので、個人差の原因を探すよりもできる人に全部やらせた方が早いと考えていたのだと思います。今はそれもできませんので、きちんとボスと話をしてこの件については個人の手技の問題と片付けてしまわないではっきりと原因を探す必要があることを伝えたいと思います。
とも様
アゴニストに関しては分注して-80℃保存をしていたものを複数種使って確認しましたがどれもリン酸化なしだったのでおそらくはアゴニストよりも細胞側もしくは操作の問題かなと考えておりました。
ただ、確かに-80でも時間によって分解するものはありそうなので、新しく購入できるものは購入したいと思います。
ERKリン酸化の度合いですが、Vehicleの定量をすると2から3倍はあったと思います。少なくともアゴニストありではっきりと濃いバンドが見え、私の薄いバンドとは明らかに違う印象でした。トラフェなしではリン酸化しないことは過去に確認されているようです。
こん様
ソニケーションによる破砕は試したことがありませんでした。私もCST社の抗体を使用していますのでそのプロトコールを確認してみたいと思います。
り様
時間のカウントの仕方（どの時点でタイマーを開始するか）や止め方に関する個人差はかなりありそうです。実際に過去の人たちがやっていた方法を見ていないので、数分でもかなり変わってしまうこともあり、その点はかなり心配しています。一応プロトコール上はLysis bufferを入れて止める、となっておりました。（本来はPBSで洗うべきなのですが、過去の検討によりそれは廃止にされたようです）
5分がピークだという過去データに従っていましたが、確かに人それぞれ少しずれが出てしまうことがあるのかもしれません。タイムコースを試すことを検討してみたいと思います。
おお様
培地交換時の洗いに関してはプロトコールに記載がありませんでしたので気が付きませんでしたが、確かに人によっては当たり前のこととして記載が省略され、やる人とやらない人がいたのかもしれません。試してみたいと思います。
ボスが細胞培養経験ない人なので、細かい培養の手技はラボ内でも統一のプロトコールがなく、経験者はそれぞれの手技で、新人は誰に教わったかでかなり違ってそうなので、その辺の影響もありそうです。
私も培地や薬液の入れ方でベースが変わってしまうのではないかと心配してます。薬液を直接添加のほうもいろいろと問題は出てきそうですが、検討してみたいと思います。
血清によるERKリン酸化に関してもKIO様ご提案のPhorbol esterによる刺激と並行して試してみたいと思います。
KIO様
トラフェ抜きのポジコンは抗体がない現在のラボの状況からしてすぐにできる一番いい案かもしれません。この結果次第ではボスの説得しやすくなると思います。
確か少しだけPMAがあったはずなのでそれを使用している文献を探してみたいと思います。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加