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(無題) 削除/引用 No.7051-10 - 2018/07/10 (火) 19:51:16 - がぁが デフォルトでは、peptide toleranceの値が1.2となっているのですが、これは大きすぎると思います。この値を小さくすると閾値が下がって有意な同定ができやすくなります。装置やキャリブレーションにもよると思いますが、0.4から0.6でやっています。また、検索対象の生物分類群を絞ることと、missed cleavageの値を大きくしすぎないことも大きな効果があります。 ピークリストについては、どのサンプルにも共通するマトリクス由来のピークを除いておくとか、ピークリストをエクセルで編集し、S/Nの小さなピークは除外しておく、等も有効です。

(無題) 削除/引用 No.7051-9 - 2018/07/06 (金) 07:48:58 - おお やったことはないんだけど、ポジかどうかは閾値設定でなんとでもなるんだと思うし、あなたがポジティブコントロールで検出した結果でポジティブと出るような閾値があなたの今の実験の系で検出できうると考えられる基準で、それが一般的な閾値よりゆるすぎるとあなたの実験系ではノイズが多くなる可能性が高くなるということではないでしょうか？ http://www.matrixscience.com/help/scoring_help.html

(無題) 削除/引用 No.7051-8 - 2018/07/05 (木) 23:03:57 - qq mascot peptide mass fingerprintのExample of results reportを見ればわかるかと思います。 結果に網掛けから外れた赤いバーが出ると、とりあえずOKという感じです。 mmassを使うとmascotに投げる前のピーク分析が比較的楽になると思いますが、慣れるのに少し時間がかかるかもしれません。 ところで、データベースはswiss-protじゃないかなあ？ 生物種で選べないのかもしれないけど、どうだろう？

(無題) 削除/引用 No.7051-7 - 2018/07/05 (木) 20:49:59 - ｍｓ解析初心者 アドバイスありがとうございます イオン化法はMALDI　を用いております ポジコンとして置いたタンパクとMS DIGEST SEARCH の結果を見比べた結果、 おおよそ５つくらいはこれかなと言うm/z のピークは確認できました いくつくらいヒットするピークがあれば同定できるのでしょうか 何度も質問申し訳ありません

(無題) 削除/引用 No.7051-6 - 2018/07/05 (木) 09:46:04 - qq 1)既知のタンパク質をPMFして、ポジコンを取る。 2)mascotで生物種、酵素、修飾を適切に選択する。 3)ゲルを消化するよりも、転写してPVDF膜で消化するほうが簡単だと思う。 4)見当外れな候補たんぱく質が何だったか明かにし、なぜ見当外れだったのかを明示する。

(無題) 削除/引用 No.7051-5 - 2018/07/05 (木) 09:43:50 - cDNA ポジコンもうまく行かないのは問題ですね。 まず、MALDIでしょうか？ESI？ MALDIだと、キャリプレーション用のスポットを囲むスポットしか精度が出ない事を前提にすること。 違うスポットのデータと混ぜないこと。 同じスポットでも測定条件の違うデータを混ぜないこと、などが意外に重要です。 キャリプレーションのずれを考慮して、mascotでのトレランスを緩く設定してもポジコンの正しいものがヒットしないのか。 例えば、下記のようなサイトでポジコンの断片を調べておき、それぞれのピークがあるのか無いのかを確認して、キャリブレーションがずれていないかを確認してください。 https://web.expasy.org/peptide_mass/ また、ESIの場合、2価、3価イオンになっていれば、それを考慮しないとヒットしません。それぞれのピークの同位体分布を見れば、価数が分かります。mascotを手動でやっているのか、装置についているソフトを経由しているかにも依りますが、手動でやった方がいろいろよく理解できると思います。 心配されているように、すべてのピークを入力するよりも、限定した方がヒットしやすいことはよくあります。

(無題) 削除/引用 No.7051-4 - 2018/07/05 (木) 09:05:13 - MS解析初心者 > ＞全く見当はずれな候補 > > 思い込みが先行してなかったよいのですが。 > > ネガコンをおいているか。 > それぞれのペプチドの情報だけでなくCoverageなどで評価しているか。 ありがとうございます。ポジコンとして置いたタンパクもmascot searchでヒットしないです（データベースはNCBIを使ってます） ピーク選抜などをすればちゃんとヒットするものなのでしょうか

(無題) 削除/引用 No.7051-3 - 2018/07/05 (木) 03:19:02 - おお ＞全く見当はずれな候補 思い込みが先行してなかったよいのですが。 ネガコンをおいているか。 それぞれのペプチドの情報だけでなくCoverageなどで評価しているか。 など気になるところです。 ようわからんけど、当てるデーターベースによって見つからなかったりするのかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.7051-2 - 2018/07/05 (木) 03:06:57 - おお MSでシーケンスまで持ち込めませんか？

質量分析からのたんぱく質の同定 削除/引用 No.7051-1 - 2018/07/05 (木) 00:10:09 - ｍｓ解析初心者 ms 解析初心者です 現在行っている実験に関連して、SDSのバンドからpmf法によってたんぱく質の同定 をしたいのですが、なかなかうまくいきません。 イオン化したものはちゃんとシャープなピークとしていくつかのm/zに出るのですが、 mascot search にかけても全く見当はずれな候補たんぱく質が表示されてしまいます どうにかして候補を絞り込みたいのですが、何かアドバイスを頂けないでしょうか よろしくお願いいたします

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