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(無題) 削除/引用 No.7046-37 - 2018/07/16 (月) 15:23:53 - コンタミ原因解明中 コメントありがとうございます。 >右下に大きな細胞集塊があり、左側には細胞が全くない こちらに関しましては、小さいデブリを見やすくするため ディッシュの辺縁に近い部位で底面に空隙のあった部分を見ております。 全体的には均一にまけていると思います。 同じ部分を見るようにしてもうしばらく様子を見てみます。

(無題) 削除/引用 No.7046-36 - 2018/07/16 (月) 15:03:59 - おお 一見見ると何かデブリにみえます。細胞があまり調子よさそうじゃないのでそういうのが原因かもしれません。増えないのもそのせいかもしれない。 真菌類にしては小さすぎると思います。小さな粒子はブラウン運動でも小刻みに振動したりして動いたりします。 マークをつけるなど何らかの工夫をして、一日後などの同じエリアをみると増えているか確認しやすいです。

(無題) 削除/引用 No.7046-35 - 2018/07/16 (月) 14:39:04 - み >[Re:34] コンタミ原因解明中さんは書きました : > > 他のラボからきれいなHEKをもらえたので普通に培養したところ > コンタミらしい様子は見られませんでした。 > ttps://ibb.co/gew5td > > ただ、気がかりな点は、上記は培地を変えて4日目(HEKは2日目)の写真ですが、 > これ以上増える気配が無いこと、また細胞も増殖がかなりゆっくりになっていることで、 右下に大きな細胞集塊があり、左側には細胞が全くない写真ですね。 どんな変な撒き方をされたのか知りませんが、この状況だと増殖できるのは集塊の辺縁部に位置する細胞くらいですよね？ トリプシンでばらして撒き直した方が良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7046-34 - 2018/07/16 (月) 12:13:20 - コンタミ原因解明中 先日はコメントをいただき大変ありがとうございました。 その後の経過報告をさせていただきますと、 やはりストックがコンタミしていたように思います。 他のラボからきれいなHEKをもらえたので普通に培養したところ コンタミらしい様子は見られませんでした。 ttps://ibb.co/gew5td 同じ培地(カナマイシン(-))で別のストック(Neuro2A)を改めて起こしてみたところ やはりつぶつぶしてもぞもぞ動くものが現れてきたのでコンタミではないかと思います。 ttps://ibb.co/eDHBYd ttps://ibb.co/keuEmy (鏡筒を携帯のカメラで覗き込んでいるので反射光が写り込んでいます) ただ、気がかりな点は、上記は培地を変えて4日目(HEKは2日目)の写真ですが、 これ以上増える気配が無いこと、また細胞も増殖がかなりゆっくりになっていることで、 現在のところ、死んだ細胞から出たものでは？という 皆様のコメントをもとに培養を続けております。(HEKとは別のインキュベータ) 真菌類なら成長はゆっくりなのでこんなものなのでしょうか？ また、培地を希釈して培地のみで蒔き直すことも試したのですが、 そちらでは1週間おいても濁ってくることはなく、 その点も非コンタミ説を支持しているように思えます。 とりあえずもらった細胞の一部は丁寧に凍結保存し液体窒素に入れたので HEKに関しては当面の問題は解決したのですが、 HEK以外の細胞株については未解決なのでもうちょっと調べてみたいと思います

(無題) 削除/引用 No.7046-33 - 2018/07/05 (木) 10:55:33 - おお >[Re:28] コンタミ原因解明中さんは書きました : > 濁りについてですが、コメントを参考にカナマイシンを入れたこともあり、 > かなり頻繁に培地を交換してしまっているため、明確に濁った、 > というところまでは観察しておりません。 > 一晩経つと20倍でみてもつぶつぶした感じで見えるのですが、 > 下記コメントでいただいたリンクの画像ほどの密度までは増えることはありませんでした。 カナマイシンが除去できる可能性があるときくと聞く前からコンタミと感じていたはずではないですか？その時はどうだったのですか？ どうも判断つかないのなら、その培地をカナマイシンフリーで１０倍以上希釈してからのフラスコに移してきっちり蓋をして、培養室の外にしばらく放置してみてください。 それか細胞の方をコンタミと判断がつくまではしばらく培養、継代してみてはどうかと。カナマイシンなしとありで並行して。 真剣にコンタミ除去するなら抗生物質いりの培地で最初は１、２時間おきに培地をかえて、数時間に一回、半日に一回とじょじょに間隔を広げて行くぐらいやらないとなかなか解消できません。 で、抗生物質入りで継代しながら、一部抗生物質抜き（PSのみ）で培養してコンタミが解消されているか確認していき、コンタミした菌がふえなくなるまで抗生物質処理を続けることになると思います。ただ、途中でガンガンに増えてきて対処不能になることもかなりあります。 カナマイシンで抑えられるなら酵母ではないでしょう。 > 一晩経つと20倍でみてもつぶつぶした感じで見えるのですが、 > 下記コメントでいただいたリンクの画像ほどの密度までは増えることはありませんでした。 それ以上増殖しなかったって言うことですか？それならコンタミとはいえないとおもいますけど。起こしたときの細胞の調子はどうでしたか？

(無題) 削除/引用 No.7046-32 - 2018/07/05 (木) 10:32:28 - おお >[Re:30] lipidさんは書きました : > gram +の青色優勢であるなら、相談者のお話から想定できる菌体（球菌か酵母）の可能性が高くなります。 > Gram –赤色優勢なら、細胞由来の成分の可能性が出てきます（Gram –の菌体の存在を否定するものではありません） > > それ以降の細かい話は検鏡自体の慣れが必要ですのでが、まずは大まかでもいいと思います。 > > グラム染色以外にも方法はりますので、あまりこだわらず他にできる方法へシフトするのも吉ですよ。 > > 方法は1つでありませんし、この手のコンタミが一旦起きると、なかなか原因を突き止めるのは難しく、憶測・推測を排除するのが最短です。 > で、上記の結果から原因に関して何が言えるのでしょうか？読んでる私はぱっと来ません。

(無題) 削除/引用 No.7046-31 - 2018/07/05 (木) 10:29:41 - おお >[Re:27] lipidさんは書きました : > >どんな鈍い人でもどんどん増えてきて対処できなくなるので > と、相談者は書かれてません。 > > >明らかに培地がにごってくるようだったら完全にアウトだし。 > これもそう書かれていません。 > > >４０倍ぐらいで非常に細かい細胞のデブリみたいなのは区別つくのでしょうか？ > つけるための染色。 > > 上記はどうでもいいですが、 > 相談者が、染色してみますとの事でしたので、 > お聞きしたまでですが、その結果はいかがでしたかね？ > どうでもいいですか？どのように解決していくのか情報をシェアしていただけるのかと思ってましたが。

(無題) 削除/引用 No.7046-30 - 2018/07/05 (木) 10:21:18 - lipid もしグラム染色ができるようでしたら、 Sup.を遠心濃縮してスメアを作って染色してください。 菌体を見るのではなく、まずは全体の色調を見てください。 gram +の青色優勢であるなら、相談者のお話から想定できる菌体（球菌か酵母）の可能性が高くなります。 Gram –赤色優勢なら、細胞由来の成分の可能性が出てきます（Gram –の菌体の存在を否定するものではありません） それ以降の細かい話は検鏡自体の慣れが必要ですのでが、まずは大まかでもいいと思います。 グラム染色以外にも方法はりますので、あまりこだわらず他にできる方法へシフトするのも吉ですよ。 方法は1つでありませんし、この手のコンタミが一旦起きると、なかなか原因を突き止めるのは難しく、憶測・推測を排除するのが最短です。

(無題) 削除/引用 No.7046-29 - 2018/07/05 (木) 09:32:01 - m 画像をアップロードしてみては？

(無題) 削除/引用 No.7046-28 - 2018/07/04 (水) 20:19:37 - コンタミ原因解明中 いろいろとコメントをいただき本当に助かります。 グラム染色ですが、その後サフラニンOも見つけまして いそいそと取り出してきて、さあやるぞと意気込んでいたのですが、 しゅう酸アンモニウムとヨード/ヨードカリウムが試薬庫になく、 実験できないことがわかりました。 大変申し訳ないのですが依然として染色できておりません。 周りの知り合いで持っている人がいないか現在調べております。 濁りについてですが、コメントを参考にカナマイシンを入れたこともあり、 かなり頻繁に培地を交換してしまっているため、明確に濁った、 というところまでは観察しておりません。 一晩経つと20倍でみてもつぶつぶした感じで見えるのですが、 下記コメントでいただいたリンクの画像ほどの密度までは増えることはありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.7046-27 - 2018/07/04 (水) 18:18:41 - lipid >どんな鈍い人でもどんどん増えてきて対処できなくなるので と、相談者は書かれてません。 >明らかに培地がにごってくるようだったら完全にアウトだし。 これもそう書かれていません。 >４０倍ぐらいで非常に細かい細胞のデブリみたいなのは区別つくのでしょうか？ つけるための染色。 上記はどうでもいいですが、 相談者が、染色してみますとの事でしたので、 お聞きしたまでですが、その結果はいかがでしたかね？

(無題) 削除/引用 No.7046-26 - 2018/07/04 (水) 17:11:13 - おお いやーどんな鈍い人でもどんどん増えてきて対処できなくなるのでそれでわかると思いますけどね。 明らかに培地がにごってくるようだったら完全にアウトだし。 ほかの皆さんはグラム染色でコンタミを判断しているのでしょうか。４０倍ぐらいで非常に細かい細胞のデブリみたいなのは区別つくのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7046-25 - 2018/07/04 (水) 15:56:06 - lipid 培養細胞のコンタミの場合のアルゴリズムは決まっていると思いますが、 研究室ではそういったものもなく、問題なのは微生物汚染であるかすらはっきりしていない事です。 細菌か酵母かになるケースと思いますが、 グラム染色できるようですので、確認すべきでしょう。 文脈から、あたかもブドウ球菌を示唆する感じですが、 微生に精通してないと、見間違えもあるでしょう。 臨床分離する際、×100抗菌薬下で行ったりしますが、 最近のコンタミなら、どのような場合でも対応できますし、 それに応じたアドバイスもできるでしょう。 真菌なら、また然り。 コンタミかもしれない者が、なんだかももわからないのに、 感染源をたどれませんし、対応もできないと思います。 慣れれば×400でも判別は可能です。

(無題) 削除/引用 No.7046-24 - 2018/07/04 (水) 15:14:23 - moz 画像検索すると、 www.learningatthebench.com/cell-culture-contamination.html とか。

(無題) 削除/引用 No.7046-23 - 2018/07/04 (水) 14:13:05 - おお 染色をやってみるのは別にいいけどバクテリアだと５００ｘぐらい必要ないの？ でもそもそもそれぐらいの倍率で見れるならなんか染色せずにでも判断できそう。。。無理かな？

(無題) 削除/引用 No.7046-22 - 2018/07/04 (水) 11:20:51 - lipid グラム染色（クリスタル紫だけがあったのなら、単染色になると思いますが）の結果は、いかがでしたか？

(無題) 削除/引用 No.7046-21 - 2018/07/04 (水) 03:32:35 - おお >死んだ細胞のデブリを見てしまっているかどうかについてはよく考えたいと思います。 >デブリだとすれば、ミスなく何代か継代できて細胞が元気になって >死んだ細胞が減ってくれば見られなくなる、と考えても良いものでしょうか？ そうですね。コンタミが疑われるDishの培地をからのDishにうつして（場合によっては希釈して）おいておいて、そのコンタミと思われるものが増えてきて培地が濁るようならコンタミでしょう。 >ブドウ状にくっついて増えている＋浮遊物が増加する >ということからコンタミではないかと考えておりました。 コンタミですね。

(無題) 削除/引用 No.7046-20 - 2018/07/03 (火) 20:20:23 - コンタミ原因解明中 私は話で聞くだけですので本当かどうかはわかりませんが、 レードルを入れても液窒が全く取れなくなるまで使われることもあったそうです。 どうも、いっとき細胞培養をする人がいなかった時期があったのが原因で、 学生などはそこに細胞がある事自体認識していなかったようです。 細胞実験に関しては問題のあるラボであるとのそしりは免れないかと思います。。。 死んだ細胞のデブリを見てしまっているかどうかについてはよく考えたいと思います。 デブリだとすれば、ミスなく何代か継代できて細胞が元気になって 死んだ細胞が減ってくれば見られなくなる、と考えても良いものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7046-19 - 2018/07/03 (火) 17:26:34 - qqq 横槍で申し訳ないですが、 大概の細胞タンクは気相保存でも-150度は保たれるものだと思いますが、それどころか細胞が死ぬレベルで温度上昇するほど汲み出してるんですか？ 問題の多そうなラボだなあ。 死細胞が多いとオルガネラやその残骸が漏出し、そのブラウン運動を菌等と見間違う、ということも割とあるようです。

(無題) 削除/引用 No.7046-18 - 2018/07/03 (火) 17:16:48 - uno ストックを起こすときの湯浴が不潔になっているとか。

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