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(無題) 削除/引用 No.7044-6 - 2018/07/04 (水) 03:20:00 - おお 最初に書き込むときにすこしはっきりしないことがあり困ったのだけど、バックグランドはレーン上だけに出てくるのか、Membraneのいたるところに出てくるのかで対処方法の判断がかわるかもしれません。レーン上にノンスペなどのバンドが多く出てスメアーに黒くなっているようなら、抗体の量で調節できる可能性が高いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7044-5 - 2018/07/03 (火) 19:12:37 - rfcgvbhjにkろ；： もともとメチル化修飾を受けている細胞内蛋白質は割りと多いので、ブロッキング剤が原因でBGの上昇や、吸収／競合によるシグナル低下はあり得ます。そういう時、Protein free blocking bufferはしばしば良好な結果をもたらします。BGが汚い抗体のウェスタンで使用して高いBGが大きく改善した事があります。

(無題) 削除/引用 No.7044-4 - 2018/07/01 (日) 19:09:38 - おお あと、検出用のECLなどのキットですが、検出感度の低いものをあえて選ぶこともありかと。

(無題) 削除/引用 No.7044-3 - 2018/07/01 (日) 19:07:26 - おお バックがでるなら抗体濃度をさげると単純な発想がうまくいく場合もあります。条件を厳しくしていくのもありますが、monさんの指摘ではBSAの濃度が高いですね。抗体のIncubationの時間も３０分ぐらいでいいのかもしれません。洗いの時間回数を増やすだけでも結構こんとろーるできる場合もあります。 すでに指摘がありますようにPVDFでやっているならニトロセルロースに変えるのもバックがあがったときの一つの対処方法としてありだと思います

(無題) 削除/引用 No.7044-2 - 2018/06/30 (土) 12:43:30 - mon 以下の抗体でしょうか。 https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/symmetric-di-methyl-arginine-motif-sdme-rg-multimab-rabbit-mab-mix/13222?&print=true nitrocellulose membraneを使用していますね。。PVDFではBackが高いのかも。 また、Blockinｇには5% w/v nonfat dry milk（TBST)、抗体希釈には、5% BSA（TBST)を使っていますね。

対称性ジメチル化抗体について 削除/引用 No.7044-1 - 2018/06/30 (土) 10:07:13 - MR Type-II arginine methyltransferaseによって修飾される対称性ジメチル化抗体をCSTから購入しました。うさぎのポリクロです。 この抗体の特異性を調べるため、酵素阻害剤であるEPZ00156で細胞を処理したものとしていないものとでウエスタンによる評価を行いました。 確かに阻害剤の方でバンドは消えているようにも思えるのですが、如何せんバックが高く困っています。 2通りの抗体インキュベート方法を試しました。 一つ目は我々のラボでいつも使っている5％スキム milk in TBS-T。もう一つは2％ BSA in TBS-Tで一時間ブロッキングしたのち、同バッファーで希釈したもので1時間、室温、さらに、同バッファーで2次抗体を希釈したもので一時間室温インキュベートしました。 結果、スキムでは全くバンドは出ず（30分フィルムに焼き付けても）、もう一方の方では数秒でバックがあがりました。 以上より、ブロッキングがふさわしくないことが考えられます。 今、もう一度電気泳動からやり直していますが、どうしたらいいのかさっぱりで、お知恵を拝借できますと幸いです。

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