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(無題) 削除/引用 No.7007-3 - 2018/06/15 (金) 14:03:15 - 53s totoさん、どうもありがとうございます。 なるほど、絶対的な基準などは存在しないんですね。overnightぐらいで見ようと思うので、ほぼ完全欠失培地で細胞が息絶えてしまわぬように、ごくごく微量のMet, Cysだけ加えてやってみようかなと思います（さじ加減が難しいかもしれませんが…）。 トライアンドエラーかもしれませんね、アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7007-2 - 2018/06/15 (金) 12:49:00 - toto 永遠の悩みの種ですね。もちろんcoldアミノ酸を加えた方が良いのですが、そうするとほぼchaseになるので当然ながら蛋白への取り込みが顕著に減ります。それで日オーダーでやるsteady-state labelingの場合はcoldも多少は加えて、pulse的に分オーダーでラベルしたい場合にはhotだけにして、というのが、普通かと思います。短い時間ならば細胞内でのMetの減少はたいしてないだろうという仮定のもので。なんにしてもバンドが出なけりゃデータにもなりません。

[35S]-Met,Cysの取り込み実験 削除/引用 No.7007-1 - 2018/06/15 (金) 11:18:33 - 53s HEK293を、35SラベルされたMet, Cys混合液を添加した培地で培養し、目的とする特定の短鎖ペプチド配列が細胞内で産生されているかを見る、という単純な実験を行おうとしているのですが、coldなMetとCysを添加すべきかどうか（するとして、どの程度）を悩んでいます。 用いる培地はDMEM-Met-Cysで両アミノ酸欠失培地なのですが、35Sミックス（perkinelmer.com/product/easytag-tm-expre35s35s-protein-labeling-neg772002mc ←本文にURLがあるとエラーで投稿できないようなので、先頭のｗｗｗを省略しました）のラベルから計算すると、この35Sミックス原液は9.4 uMとなり、最終濃度は当然ですがごく微量になる感じです。 やはりcoldなアミノ酸を、通常濃度とまでは行かずとも、ある程度加えた方がよいものなのでしょうか？ 経験ある方、もしくは情報をお持ちの方がいらっしゃいましたら、ご教示いただけると助かります。

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