全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6994-8 - 2018/06/14 (木) 06:03:25 - おお PFA固定で賦活化は必要ないかなというのが第一印象です。膜タンパクだともしかしたらPLP固定の法が良いかもしれません。有機溶媒系の固定方法もありますけど、将来的にどういったサンプル、固定法で使うかという観点から選択するのがいいかと。もちろん細胞表面にエピトープ部位が露出しているときは固定せず抗体を反応させることもできますし、その後そのまま、あるいは固定して観察ができますが、細胞内にあるものが染まりませんので（小胞体、ER、ゴルジなど）、固定後の染色でスクリーニングしたほうが用途としては幅広いものが拾えるんじゃないかと。どうしても引っかからないなら賦活化あ固定法の変更はあり得るのかもしれませんが（エピートープが構造上奥まったところにあるとか言う場合何でしょうけど）、、、まあその時は賦活化に関しては割り切って酵素を使ったできあいのキットでやるくらいでしょうか。ただそういう場合は全部スクリーニングするよりWBで使えたものから選んだほうがいいような気がします。 大きな流れとしてはPFA固定などでちゃんと染まる抗体をスクリーニング。染色においての特異性を確認。この時点でその抗体はターゲットを染めることができるという話になるので、その抗体で実際に使うサンプルと同じ方法（パラフィン包埋してあるものとか）で用意したものを使い、賦活化が必要であれば検討するという流れかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.6994-7 - 2018/06/14 (木) 00:03:58 - あwせろp；。：／」 培養細胞の免疫染色で賦活化が必要なケースはあるとしても極めて例外的と思います。組織、細胞ともに長くやってますが、そうしたケースにあたったことがなく、また周囲でも聞いたことないです。賦活化が必要になる理由は現時点でもほんとうのところは（たぶんあまりガチで追求するひとがいなかったので）よく分かっていないみたいですが、抗原部位が蛋白質分子内に隠れたり、長時間の固定処理による蛋白質分子内／分子間の過度の架橋形成で抗体が反応しにくくなる事(抗原のマスキング)に必要と昔からいわれています。マスキングは長時間のPFA固定＆パラフィン包埋固定過程での過酷な処理に起因するので、そうしたプロセスを経ない培養細胞では必要としないようにおもいます。 ただ培養細胞の免疫染色では抗体によっては、一般的な免疫組織染色と比べて固定法(PFA または　低温で有機溶媒とか）との相性がわりとあったりする場合があるので、事前情報が乏しいときは、一般的な方法として汎用されているPFA固定（培養細胞では5min~15minくらいの範囲で短時間で行うことを勧めます。長いと反応性が下がります）だけでなく、冷アセトン（1~3minくらい）とか、いくつか検討したほうがよいかもしれません。たぶん耐性あるとおもいますが、有機溶媒で、使用しているディッシュやプレートなどの器材が変な風にならないかも一応確認してからの方がよいかもしれません。 また界面活性剤処理（種類と時間）も合わせて検討するとよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6994-6 - 2018/06/13 (水) 05:31:51 - mon モノクロですよね。 IHC, WB用でベストの抗体を選択したいなら、それぞれの方法（賦活化も含む）で選抜するのが定法です。蛍光免疫染色でも固定法によってベストの抗体が変わる可能性もあります。 運がよければ、すべての方法に使える抗体が取れます。

(無題) 削除/引用 No.6994-5 - 2018/06/12 (火) 19:44:47 - AA 抗原賦活化は、固定やパラフィン化等によって認識部位が マスクされてしまっているときに行うものなので、 単層の細胞でやるのであれば固定も大してしないでしょうから とりあえずはそのままやればいいと思います。 そもそもIHCとくらべてICCは染まりやすいので 余計な手間はかけないでいいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.6994-4 - 2018/06/12 (火) 13:07:19 - 774R 細胞膜のタンパク質とのことですが、もしエピトープが細胞外ドメインでしたら、固定も不要で、生きた細胞のまま1次抗体→2次抗体と反応させてやれば時間短縮になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.6994-3 - 2018/06/12 (火) 12:41:52 - AP 賦活化ってどんな抗原でも必要というわけじゃない。ふつうにやってどうしても染まらないときの手段の一つにすぎない。これから抗体をスクリーニングするんならまず賦活化なしでも染まるものを探すべき。そのほうが、あとあと使い勝手がいいでしょ。

(無題) 削除/引用 No.6994-2 - 2018/06/12 (火) 12:09:42 - 友 細胞株でやるんですよね？モノレイヤーの。ならふかつかはいらんでしょ。 細胞のペレットをパラフィン包埋して切片を染めるのならふかつかをしてもいいんじゃない。 普通に寺崎プレートに細胞撒いて、固定して穴開けてそれで染めたらいいっしょ。 IHCとWBに使える抗体が取りたいのならそれでスクリーニングもやらなきゃ。細胞株でスクリーニングは違うと思うなぁ。

免疫染色における固定と賦活化について 削除/引用 No.6994-1 - 2018/06/12 (火) 12:01:17 - KKRD 　いつも拝見させていただき、参考にさせていただいております。 基礎実験を始めてから日が浅く、免疫染色に関する知識が乏しいため、皆様方よりご教授賜りたいと思っております。 質問： 　あるタンパクA（仮称・細胞膜に発現）に対する抗体（application：IHC, WB)を委託にて作成しており、これからマウスに免疫して得られた数10〜100種類の抗体候補をスクリーニングによって適切な候補を選択する過程に入る予定です。スクリーニングの方法としまして、タンパクAを発現するとされる癌細胞株（接着細胞）を96ウェルのマイクロプレートに播いて各ウェルで抗体候補と反応させ、免疫染色で発現の有無を検討することを考えています。 　そこで免疫染色の過程適切な固定および賦活化の方法について教えていただきたく存じます。 　賦活化に関してはスライドグラスではなく、マイクロプレートなので熱処理が困難と思われます。 　また、スクリーニングに良い他の方法がありましたらご教示いただければ幸甚にございます。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---