BioTechnicalフォーラム [WBのバンド検出ムラ]

WBのバンド検出ムラ

No.6982-TOPIC - 2018/06/07 (木) 17:54:53 - こまった

ウェスタンブロッティング（セミドライ）で目的タンパクのバンド検出を
行っており、これまではそれなりに良好な結果が得られていたのですが、
突如、ここ2回の実験で検出にムラが生じるようになりました。
両端のバンドが極端に濃くなり、中央付近は逆に薄くなる傾向があります。

原因としてどのようなことが考えられるでしょうか？

操作自体はこれまでと変えた自覚はなく、ブロッティングの時には
専用のローラーで濾紙と膜とゲルを密着させています。

例えば、一次抗体を反応させる前に転写膜が乾くようなことがあると
このような検出ムラが生じたりするでしょうか？

アドバイスをお願い致します。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全9件 ( 1 ～ 9 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.6982-9 - 2018/06/19 (火) 10:13:30 - こまった

アドバイスをいただきありがとうございました。

その後、再度実験を行いましたらムラはなくなりました。

何がクリティカルな要素だったかはわからないのですが、
抗体の当てムラ対策としては、抗体液の量を増やしました。

転写ムラ対策としては、パワーサプライの電源コードを
抜き差ししてみたり、ゲルと膜がしっかり圧着するように
気をつけたりしました。

原因は解明できていないものの、とりあえず解決して
良かったです。ありがとうございました。

(無題)

削除/引用

No.6982-8 - 2018/06/10 (日) 11:23:34 - 中年

転写ムラかそれ以降のステップのムラかは、メンブレンの総タンパク質を染色してみればわかりますよね。

(無題)

削除/引用

No.6982-7 - 2018/06/10 (日) 02:29:19 - qwsでfrgtひゅい

転写不良とおもいます。セミドライの装置とくに、電極板に原因があるようにおもいます。メーカーに相談して点検修理を検討ください。

(無題)

削除/引用

No.6982-6 - 2018/06/08 (金) 09:48:05 - AP

抗体のムラ
基質液のムラ
転写のムラ
カメラの問題（X線フィルムで検出しているのでなければ）

などが考えられます。
転写ムラに関しては、サイズマーカーを両端に加え真ん中にも置くとか、転写後の膜をPonceauで染めてみるとかすれば評価できますね。

CCDカメラの場合、flat feild image fileとかDark image fileとかで、CCDの受光素子のムラ、レンズの周辺ぼけなどを補正しているわけですが、選択している補正用ファイルが間違っているとか、経年劣化によって補正があわなくなっているとかで、画像にムラが出る可能性はあります。

薬液のアテ方によるムラなら、注意してやって、としか言いようがない。
ちなみにどのようにしてやっていますか。

(無題)

削除/引用

No.6982-5 - 2018/06/08 (金) 09:26:42 - こまった

返信が遅くなりすみません。

そうです、12レーン泳動して転写・検出したバンドのうちの、
両端（右端と左端の各2レーン前後）のバンドが極端に濃くなります。

抗体の当てムラ、でしょうか？

(無題)

削除/引用

No.6982-4 - 2018/06/08 (金) 07:10:32 - qq

>両端のバンドが極端に濃くなり、中央付近は逆に薄くなる傾向があります。

バンドの両端が極端に濃くなり、中央付近は逆に薄くなる傾向があります。
ではないのだろうか？？

(無題)

削除/引用

No.6982-3 - 2018/06/08 (金) 06:03:16 - Green

これだけの情報だけだとわからないけど、抗体のあてムラのような気がする。