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APさんありがとうございます。 削除/引用 No.6975-4 - 2018/06/06 (水) 00:29:11 - ymd ありがとうございます。 吸光度を用いたcDNA量の統一はやはり正確性に欠けるのですね。 実際、様々な論文を見ても全てが内部標準を用いてノーマライズしていますしね…。 勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.6975-3 - 2018/06/05 (火) 20:22:29 - AP ・吸光度の定量はしばしばブレが大きいので、吸光度ベースで標準化するのは受け入れがたい。 ・逆転写効率は100% (鋳型RNAがくまなくcDNAを生じる）なわけではありません。 効率が良いときでも50%いくかいかないかくらいです。しかも効率はサンプルごとチューブごとに違います。したがって吸光度でそろえたRNAから等量のcDNAができるという根拠はありません。

リアルタイムPCRの絶対定量　内部標準 削除/引用 No.6975-2 - 2018/06/05 (火) 20:17:41 - ymd 申し訳ございません。 一部文字化けしていました。 7行目の「液量」のあとのカッコ内には マイクロリットル という言葉が入ります。

リアルタイムPCRの絶対定量　内部標準 削除/引用 No.6975-1 - 2018/06/05 (火) 20:09:39 - ymd あるタンパク発現についての研究の一環として、当タンパクのRNA発現量を、リアルタイムPCRを用いた絶対定量で評価しようとしています。 そこで、検量線を用いた絶対定量に際して、内部標準を用いた標的遺伝子のノーマライズが必須なのかを教えていただけないでしょうか？ 私はまず、組織サンプルからtotal RNAを抽出後、オリゴdTプライマーでmessenger RNAからcDNAを作製し、吸光度計でcDNA量を測定後に冷凍保存していました。 そしてリアルタイムPCRで解析する際に、サンプルのcDNA量を全て液量(µl)ではなく質量(ng)で統一し、解析しました（私の場合は全てのサンプルcDNAを700 ngにしました）。 この場合、スタート時のサンプルcDNA量が統一されているはずなので、増幅時に内部標準でノーマライズする必要が無いように感じるのですが、いかがなのでしょうか？ 検量線を描くための標準物質は、解析目的のcDNA配列を含むクローニングDNAを導入したプラスミドDNAを用いているために、濃度既知の条件にあります。 どうか教えていただけないでしょうか。よろしくお願い申し上げます。

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