初めての投稿です。
よろしくお願いします。
現在、アグロバクテリウム法によりタバコ培養細胞BY-2の形質転換を試みているのですが、うまくいきません。抗生物質を添加した培地に形質転換後の細胞をまくとカルスは生えてくるのですが、顕微鏡で観察してもGFPの蛍光が見えず形質転換されていないのです。原因が全く分からず困っており、アドバイスをいただけると幸いです。プロトコルは以下の通りです。
1. エレクトロポレーション法によりプラスミドを導入したアグロをLB培地に入 れ、27 ℃で2日間培養する（プレカルチャー）。
2. 継代2日目のBY-2を4 mLとり、シャーレに薄く広げる。それにアグロのプレカルチャーを100 µL加え、27 ℃で2日間培養する。
3. アグロを感染させたBY-2を3 % スクロース溶液で3回洗浄し、抗生物質（ハイグロマイシンまたはカナマイシン）を添加したL培地（改変リングスマイヤー・スクーグ培地）にまく。
4. 生えてきたカルスを顕微鏡で観察する。
こんな感じです。アグロは購入したばかりの新品を使用しています。また、プレカルチャーの際に余計な菌がコンタミしているのではないかと疑って、プレカルチャーに抗生物質を加えてもみましたが、アグロは増えても形質転換はできませんでした。また、使用しているプラスミドをパーティクルガン法によりBY-2に撃ち込んだところ形質転換できたので、プラスミド自体には問題はなさそうです。BY-2に加えるアグロの量を減らしてもみましたが、やはりうまくいきません。そもそも、形質転換されていないのになぜ抗生物質入りの培地でカルスが生えてくるのかも分かりません（全く生えてこないこともあるので、抗生物質が効いていないわけではないと思います）。分からないことだらけですが、アドバイスよろしくお願いいたします。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加