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(無題) 削除/引用 No.6970-5 - 2018/06/03 (日) 18:16:16 - PKWY ＞精製、保存中などにおかしくなっている可能性です。 なるほどです。

(無題) 削除/引用 No.6970-4 - 2018/06/03 (日) 17:54:13 - おお >Cas9によってドナー側のプラスミドにニックが入っている可能性がある」という理解でよいでしょうか。 精製、保存中などにおかしくなっている可能性です。

(無題) 削除/引用 No.6970-3 - 2018/06/03 (日) 17:14:59 - PKWY おおさん、返信を有難うございます。 ＞前任者はなんと言ってますか？ 今、問い合わせている最中です。 ＞GFPの前のLoxあたりから変になってしまっているクローンをひろったのだろうと思いますけど… コンストラクトの途中から異変が起こったりするのですね…今まで経験がなく知りませんでした。 ＞プロトコールを見直す必要があるかもしれません。 ＞導入したDNAにニックとか入っていて入りにくくなっている可能性もあるかもしれません。 了解しました。因みに「Cas9によってドナー側のプラスミドにニックが入っている可能性がある」という理解でよいでしょうか。その場合は、目的株が得られるまで何度か試してみるしかないのでしょうか…？ ホスト側に問題がある可能性もありますか？例えばAAVS1locusでも他のtarget siteに変更してみるなど、もし何かアドバイスがありましたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.6970-2 - 2018/06/03 (日) 10:24:31 - おお 前任者はなんと言ってますか？ GFPの前のLoxあたりから変になってしまっているクローンをひろったのだろうと思いますけど、拾ったクローンはセレクションによってはもともと同じクローン由来であったという可能性も否定出来ないのでそのあたりのプロトコールを見直す必要があるかもしれません。 導入したDNAにニックとか入っていて入りにくくなっている可能性もあるかもしれません。

CRISPRによるtdTomato-GFP安定発現ES細胞株の樹立 削除/引用 No.6970-1 - 2018/06/03 (日) 06:42:01 - PKWY CRISPR/Cas9(WT)を使って、ES細胞のAAVS1領域に下記のカセットを（相同組換えにより）挿入し、安定発現株を樹立しました。 ｛LHA-CAG-loxP-MARKS-tdTomato-loxP-MARKS-GFP-RHA｝ Tomatoを発現するコロニーを選択して、7lineの細胞株を得たのち、上流と下流それぞれ組換え部位を認識するprimerでgenotypingを行ったところ、いずれも上流では特異的バンドが確認できましたが、なぜか下流では（複数のprimerで試しても）特異的バンドが確認できませんでした… しかし、CreによってGFPさえ発現すれば実験には使えると思っていたのですが、TAT-CreをトランスフェクションしてもTomatoを発現したままで、GFPに変化する細胞はありませんでした… genotypingの結果から、少なくとも上流では正しい位置にカセットが挿入できていると思うのですが、�@なぜ下流はPCRがかからないのか、�AなぜCreによってGFPが発現しないのか、理由がわからず困っています。 前任者は同じコンストラクトで、CreによりGFPを発現する細胞株が得られていたのですが、何か考えられる問題点はありますでしょうか？

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