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(無題) 削除/引用 No.6959-15 - 2018/08/12 (日) 16:14:27 - わじゅkml、。 すこし面倒だけど、2次元電気泳動。LC-MS/MSが登場するまでは蛋白質の分離に困ったときはとりあえずこれだった。いまはいろんなpIレンジの出来合いのゲルもあるし、高分子量蛋白質の解析や塩基性側の分離不良も改善されてる。ひと昔前よりもはるかにコンパクトで手技的にも格段に簡単になってる。

(無題) 削除/引用 No.6959-14 - 2018/08/08 (水) 15:50:50 - おお ヘビーチェーンに近いところに目的のバンドがあるなら、ライトチェーンスペシフィックな２次抗体が売られています。 https://www.jacksonimmuno.com/catalog/7 これをもう一度あげときます。

(無題) 削除/引用 No.6959-13 - 2018/08/08 (水) 12:52:45 - 免疫沈降初心者 すいません、ちょっと冷静になって考えてみたら、普通の2次抗体だけでバンドが出るか調べれば、ノンスペシフィックバンドかどうかわかりますよね。ちょっと焦っておりました。

TrueBlotを使ったIP-WBの結果の解釈 削除/引用 No.6959-12 - 2018/08/08 (水) 11:50:45 - 免疫沈降初心者 別の仕事に時間を取られ一月半ほど間が空いてしまいましたが、その後IP-WBを試してみました。 免疫沈降には手持ちのポリクロgoatの抗体を使いました。ネガティブコントロールとしてgoat IgGで免沈したものを用意しました。 まずはreducing agent有りでのIP-WBを試してみたところ、案外にうまくいったようで、従来知られていたisoformのサイズのバンドがきっちり検出されました。ネガティブコントロールのレーンでは全くバンドは見られませんでした。 問題の、新しく見つけたvariantに相当するサイズのバンド（45kDa程度）も検出されたのですが、ネガティブコントロールのレーンでも検出されてしまいました。 そのバンドが、IgGに由来すると思われる50kDa程度のバンドに近いこともあり、とりあえずこのIgGバンドを軽減する目的で、FDさんが紹介して下さったTrueBlotを試してみたところ、IgGバンドはかなり減弱し（完全になくなりはしませんでした。IPに使った抗体に由来するIgG分は無くなったが、血清由来のIgGバンドが残った？）、かつ、variantに相当するバンドがネガティブコントロールのレーンで完全に消失しました。 これはどう解釈したものでしょうか？素直にvariantだけが同定できたと考えても良いのでしょうか？TrueBlotで消えるのは免沈に使った抗体由来のIgGバンドのはずなので、つまり50kDa、25kDaのバンドになると思うのですが、消えたのはその二種類のバンドとは明確に区別できるサイズのバンドなのです。

(無題) 削除/引用 No.6959-11 - 2018/06/01 (金) 00:12:50 - 免疫沈降初心者 皆様、引き続きアドバイスありがとうございます。 抗体に関して、ELISAに使えるものはIPにも使える可能性が高いというのは確かになるほどと思いました。手持ちの抗体でうまくいかなかったら、次はそういう抗体を試そうと思います。 （しかし、メーカーはなぜそういう抗体でIPも試さないのでしょうね？カタログにIPにも適用可能と謳ってあれば購入意欲が沸く人も増えるだろうと思うのですが。私のようにIPに不慣れな人が多くて、そういう人からのクレームを恐れているのでしょうか？） VTさんの仰る >メインとバリアントのタンパクがヘテロダイマーになる可能性 について、実際その可能性を考えていまして、むしろそうだったら新しい発見として論文のネタになると思っており、それを調べようと思っています。なので、非還元状態でのWB”も”試したいと思っております（場合によっては、非還元->還元での2D。これは過去のトピックでおおさんがそういうアドバイスをされていたのを見たことがあり、なるほどと感心しておりました）。なので、FDさんの教えて下さった二次抗体はかなり面白いと思ったのですが、とりあえず今のところは見送りです。

(無題) 削除/引用 No.6959-10 - 2018/05/31 (木) 07:53:31 - VT ELISAの抗体でIPできるような気がします。メインとバリアントのタンパクがヘテロダイマーになる可能性があるならば、還元状態で検出する方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.6959-9 - 2018/05/30 (水) 11:55:46 - おお ヘビーチェーンに近いところに目的のバンドがあるなら、ライトチェーンスペシフィックな２次抗体が売られています。使っているのはマウスIgGに対してのものはポリクロのライトチェーンスペシフィック２次抗体でラビットの方はモノクロのライトチェーンスペシフィック２次抗体しかなかった。モノクロは少し感度が落ちるような感じもしています。ラビットの方はモノクロのライトチェーンスペシフィック２次抗体でプロービングしたのちさらにマウスIgGライトチェーンスペシフィック２次抗体を使うと感度は上がりますが、、、 https://www.jacksonimmuno.com/catalog/7

(無題) 削除/引用 No.6959-8 - 2018/05/30 (水) 09:52:25 - FD 二次抗体をこちらにするだけでできないでしょうか？ https://www.funakoshi.co.jp/contents/7385

(無題) 削除/引用 No.6959-7 - 2018/05/30 (水) 08:52:11 - み おおさんが仰るようにIPなしで普通にwesternやってみると良いと思う。 S-S結合で多量体形成するなら還元状態と非還元のSDS-PAGEをやって移動度が変化するかも確認できるかも。 IP産物を流す場合も非還元でやったらIgGのバンドと重ならなくなるかもね。 ELISAでworkしている抗体は生の（非変性の）蛋白を認識しているのだからIPにも使える可能性が高い。

(無題) 削除/引用 No.6959-6 - 2018/05/30 (水) 08:01:25 - 免疫沈降初心者 >[Re:5] おおさんは書きました : > >これで思ったのですが、血清中のアルブミンやIgGがほぼ除けていたら、逆にIPする必要がなくなるということでしょうか？ > > そう思います。あくまでも、ものが検出できるのに十分であれば。 > > > えっとあとから思ったのですが、IPする場合血清の抗体がIPの抗体と競合する可能性があるので、血清中のIgGなどは除いておいたほうがいいかもしれませんね。 ありがとうございます。ものが十分に多いことを期待してまずは免疫沈降抜きで、やはり検出が難しいとなれば免疫沈降有りで、実験を進めようと思います。

(無題) 削除/引用 No.6959-5 - 2018/05/30 (水) 07:35:29 - おお >これで思ったのですが、血清中のアルブミンやIgGがほぼ除けていたら、逆にIPする必要がなくなるということでしょうか？ そう思います。あくまでも、ものが検出できるのに十分であれば。 えっとあとから思ったのですが、IPする場合血清の抗体がIPの抗体と競合する可能性があるので、血清中のIgGなどは除いておいたほうがいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6959-4 - 2018/05/30 (水) 07:00:45 - 免疫沈降初心者 おおさん、回答ありがとうございます。 >リコンビナントなどの精製された蛋白で免疫したポリクロの抗体であればIPがうまくいく可能性が高いです。 調べてみたら、自分が使っているものでWBで良好な結果を出している抗体の一つが「リコンビナントなどの精製されたタンパクで免疫したポリクロgoatの抗体」でした。IPするならこれを使うことを考えてみます。 >あなたの対象の蛋白がS-S結合で複数の分子を架橋されていたらその移動度も変わりますけど。 S-S結合を介してホモ2量体を作ります。覚えておきます。 >ぐぐるとそういうキットがあるみたいですね。 両方簡単に除けるようなキット（カラム？）があるんですね。資金は結構潤沢なラボなので、どれか買って試してみようと思います。 >IPするならアルブミン除去などの必要性は感じません。 これで思ったのですが、血清中のアルブミンやIgGがほぼ除けていたら、逆にIPする必要がなくなるということでしょうか？もちろん、目的タンパクの量が極々微量であれば、除ききれなかったIgGが重なってやはりWBで検出しづらいということになるのだろうとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.6959-3 - 2018/05/30 (水) 05:36:37 - おお 3） IPするならアルブミン除去などの必要性は感じません。 直接血清をWBするならアルブミンが多すぎて泳動がきれいに流れないか、少量しか流せないのでアルブミン除去やさらにIgGなどの除去をやっておけば泳動、検出が容易になる可能性が高いです。

(無題) 削除/引用 No.6959-2 - 2018/05/30 (水) 05:25:28 - おお リコンビナントなどの精製された蛋白で免疫したポリクロの抗体であればIPがうまくいく可能性が高いです。Proteintechはそういう抗体を中心に売っています。 https://www.ptglab.com/ IPなどで抗体が邪魔なとき、メルカプトエタノールやDTTを使わず抗体のポリペプチドがばらばらにならないようにして泳動すると見やすくなる可能性があります。あなたの対象の蛋白がS-S結合で複数の分子を架橋されていたらその移動度も変わりますけど。 血清だとアルブミンと血清中のIgGなどが邪魔ですね。IgGなどはProtein A/Gビーズで除けるでしょうし。アルブミン除去もできると思いますが、ぐぐるとそういうキットがあるみたいですね。 ttp://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/protein-sample-preparation/protein-extraction/proteoextract-kits/albumin-igg-depletion/Namb.qB.9IoAAAFAP_9wFMrE,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1 ttp://www.bio-rad.com/en-us/product/aurum-serum-protein-mini-kit?ID=ada6c3bf-e7e9-4638-9fd6-79234e11b841 ttp://www.cosmobio.co.jp/product/detail/01010003.asp?entry_id=2982

血清中のタンパクを同定したい 削除/引用 No.6959-1 - 2018/05/30 (水) 04:20:17 - 免疫沈降初心者 細胞外に分泌されるタンパクを研究しています。そのタンパクは血清中に存在し、サイズがIgGに重なるためWBでは見づらいのですが、ELISAで量の測定は可能で、商用キットも出ています。 最近そのタンパクのvariantを発見しました。血清中でのそのvariantの量を調べたいのですが、ELISAでは従来知られているものとvariantとの区別が出来ないので困っています。 現在、血清にたいして免疫沈降（未経験です）し、WBで調べる方法を考えています。variantはサイズが違う（元のタンパクもvariantもどちらもIgGに近い大きさだが、その二つだけを見れば充分区別可能なレベル）のでWBで調べられるだろうことはin vitroの実験（発現ベクターを導入した細胞のserum freeなcondition mediaに対するWB）で確認済みです。 質問なのですが 1) このような状況で、免疫沈降以外の方法で調べるやり方はあるでしょうか？免疫沈降はやったことがない上、トリッキーな実験という印象があり、もし他にシンプルに調べる方法があるようならばそちらに鞍替えしたいと思っています。 2）いや、そういう時は免疫沈降が第一選択肢だろ普通、という場合、抗体の選択はどのようにするべきでしょうか？そこそこメジャーなmoleculeなのですが、調べた限りIPに使えると謳っている抗体は市販されていません。またIPしたという（信頼に足るレベルの）論文も存在しないようです。こういう場合、まずはWBで好結果を出している抗体から始めるものでしょうか？（今のところその方向で考えています）。 3）血清に対する免疫沈降で特に注意するべき点というのがもしありましたら教えていただけますでしょうか？アルブミン除去キットかなにかを最初にかますべきでしょうか？ よろしくお願いします。

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