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(無題) 削除/引用 No.6935-15 - 2018/05/28 (月) 14:44:18 - asan これはaffinity purification LC-MSの実験自体の解釈の仕方のことをいってるのか、単にexcel等でのデータプロセシングのやり方の話なのかよくわからない質問ですが,,,. 前者の場合であれば、もちろんTAPやwash条件をきつくすれば偽陽性は減りますが、どんなに頑張ったって最近のLC-MS2の感度は非常に良いので吸着したタンパク質が当たってくるのはゼロにはならないと思います。確実にポジティブなものを探したいなら複数回やるとか色々な方法はあるでしょうが、S/N比の問題にすぎませんから、ネガコンで当たってるものを引いてもいいだろうし、ratioを取ってもいいでしょうし、ネガコンで存在しないもので強度の強い順に並べても別に間違いでもありません。何れにせよ、個別分子におとしてその後の研究をするならばバリデーション実験が必要ですから、あなたの実験系での解釈次第です。 もうちょっと細かいこというなら、サンプルは前分画処理等をしてるのか定量値をどうしてるか、単にヒットしたかしてないかで議論したいのか、そういう話にもなってきます。擬似定量してるならレシオでもいいですけど、ヒットしたかしてないかというやり方は一般的なショットガンプロテオミクスDDAでは測定のランダム性があるので必ずしも正しい解釈の仕方につながらない可能性もあります。 excelで処理の話ならネットで調べれば使い方のサイトはたくさんあります。大規模にやるならプログラム言語つかってバッチ処理した方が早いし確実ですけどね。オミックスデータを将来的にも扱う可能性があるならこの際簡単なコマンドラインの処理できる言語を勉強するのも役に立つと思います。

(無題) 削除/引用 No.6935-14 - 2018/05/25 (金) 01:00:20 - 九院 WebベースでもよければVennyというサイトが便利です。 http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ シンプルにデータをコピー&ペーストすれば良いです。あとは、ベン図の必要な部分をクリックすれば、リストが得られます。

(無題) 削除/引用 No.6935-13 - 2018/05/24 (木) 19:37:00 - チス 重複がないものだけ知りたい場合は、xyzさんの方法でいいと思うのですが、 どこが重複しているかも知りたい場合は、VLOOKUP関数を使うのはどうでしょうか？ 方法としては、 ・コントロールのリスト右横に列を挿入して、タンパク質の名前の横に1,2,,,,,,とナンバリング ・サンプルのタンパク質の左横に列を挿入して、 =VLOOKUP (=調べたいタンパク質, コントロールのリストの一番上：一番下の右, 2,0） と入力するとできると思います。 （コントロールのところは絶対参照状態にしておくと、リストの全部にコピーができるので便利です） 該当がある場合、ナンバリングの数字が出ます。 該当がない場合、#N/Aと出ます。

(無題) 削除/引用 No.6935-12 - 2018/05/24 (木) 15:47:09 - xyz Mac版のエクセルは使ったことはありませんが、重複削除の機能はMac版でもあるようなので、同じ操作が可能だと思います。 文字が小さいのは...、PCのディスプレイで見てもらうしかないですね。。。

(無題) 削除/引用 No.6935-11 - 2018/05/24 (木) 15:14:52 - 質量分析 おおさま、ありがとうございます。 後で返信致します。 xyz様、今細胞培養の最中ですが動画とのことで見てみましたらすごく簡単ですね。 これ、Macでもできるでしょうか？文字が小さ過ぎて見えませんでした。。

(無題) 削除/引用 No.6935-10 - 2018/05/24 (木) 15:00:52 - xyz こういう方法ではダメでしょうか... https://streamable.com/9qu4u

(無題) 削除/引用 No.6935-9 - 2018/05/24 (木) 14:25:38 - 質量分析 monさんありがとうございます。 マクロの理解に苦戦しております。が、なんとか今週末で理解できるようにがんばります。 TAPが必須、というのは驚きました。一発でIPしてMS解析をしていそうな論文がたくさん見られたのですが、TAPせずですので、何か工夫があるかと思いましたが・・・ ビオチン化修飾タンパク質のエンリッチの場合はいかがでしょうか。 TAPはできません。今日も500 ulのlysis bufferで可溶化したcell lysateを100 mm dishから回収し、100 ulのストレプトアビジン磁気beads（ NEB）を 使って1時間室温でプルダウンし、その後RIPA bufferで3度洗い、SDS ＋ビオチンで溶出しましたが、ビオチン化処理していないコントロール群でもポンソー染色で見えるほどのバンドがでていました。 100 ulのビーズが多すぎなのかもしれませんが、この場合のプレクリアができればなと思うのですが・・・ ビオチンストレプトアビジンの相互作用であれば500 mM NaClだとか2 M尿素で洗ってもよさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.6935-8 - 2018/05/24 (木) 11:24:13 - おお mon さんが指摘していますようにTandem Affinity Purificationなどの工夫が 望ましいです。まあシングルのプルダウンでコントロールで多くの蛋白が引っかかっても、コントロールにない蛋白を探して実際のInteractorsを見つけている論文もあります。 抗体のIPだけでやる場合は工夫次第でノンスペがかなり抑えられることもあるようです。 ビーズまたは Normal IgGなどを吸着したビーズでプレクリアーする。同等のゲルなどでクロマとのような感じでフィルタリングするのも手かもしれません。セファデックス、アガロース系ならG-25やG-50の粒子の荒いグレイド（coarse）でつまらりにくいものを使うといいでしょう。ただ使い捨てになるでしょう。 ビーズの量は確かに少ないほうがいいでしょう。簡単にどれくらいの抗体が付き、ほぼ飽和状態になり、その状態でどれくらいのターゲットの蛋白が取れるのか一度ラフに見積もって見るといいです。 より厳しいバッファーを使う。しかしこれはどれくらい厳しいと目的のものがとれて、そうでないかは既知のものでしか確認しようがありません。まあ既知のものをものさしにして決めるのも一つの方法です。スクリーニングだからと言うことで細かいことは言えないがこの条件にすると割り切ってきめるとかもありでしょう。クロスリンクIPにすればかなり厳しい条件にはできると思います。IPやWashのバッファーで強い条件ならRIPA（SDS入）だと思います。このバッファーはTx-100、Deoxycholate、SDSを混合したバッファーでDeoxycholateは多いプロトコールでは１％入れているのをみました。いちどそのような条件で抗体が働くのかは見ておいたほうがいいのかもしれません。 塩濃度を上げるのは一つの工夫ですが、生理的塩濃度から離れていくと蛋白相互作用も外れていく可能性があります。それでもだめと言えませんけど。まあやるなら３００mMぐらいまでかなぁと根拠もなくおもいます。LiClを使ってバックグランドを減らすというのもあります。これも塩で弱いカオトロピック作用がありますので、やはり生理的な相互作用の一部は失われる可能性があります。 MSで解析するならBSAはあまり使いたくないですね。。。

(無題) 削除/引用 No.6935-7 - 2018/05/24 (木) 09:40:34 - mon 一回の免疫沈降ではどうしようもないです。 Tandem Affinity Purificationが必須です。 Proteomics全盛？時代に開発されています。

(無題) 削除/引用 No.6935-6 - 2018/05/24 (木) 08:53:14 - 質量分析 おお様、とても興味深いサイトをご紹介していただきありがとうございます。 実験でよく利用されるExcelの機能を紹介したサイトなのですね。すごい... ついでというと大変恐縮なのですが、コントロールのビーズにもなにかしらタンパク質が出ても仕方ないとは思いますが、実はMSにかける前に、同じサンプルを銀染色したのですが、正直、たくさんバンドが見え、差が見られませんでした。 ビーズの量を減らすことも一手でしょうか？ あるいはBSAなどでビーズをブロッキングしたり、塩の濃度を上げる（0.5Mほど？）を上げるのも一手でしょうか？実はビオチンタンパク質（膜タンパク質です）をプルダウンした実験でも同様に、ビオチン化していないにも関わらず、かなりのものが落ちて来てしまい、ビオチン化したものとで差は銀染色レベルで見られませんでした。サンプルは1％トライトンX100ベースの溶解バッファーをしようしています。

(無題) 削除/引用 No.6935-5 - 2018/05/24 (木) 06:18:16 - おお https://exceljet.net/formula/highlight-cells-that-contain これもつかえるな。

(無題) 削除/引用 No.6935-4 - 2018/05/24 (木) 06:09:56 - 質量分析 mon様、おお様、早速書き込みいただきまして、ありがとうございます。 マクロ聞いたことがあります。自分でできるかどうかわかりませんが、まずはお示しいただいたものをみて勉強してみます。 ヒントをいただき、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6935-3 - 2018/05/24 (木) 05:54:20 - おお マクロが早いと思うけど、工夫次第ではなんとかできる方法にたどり着けるはずアルファベティカルに並べるだけでもかなり助けになると思う。 https://exceljet.net/formula/exact-match-lookup-with-sumproduct これで同じものが抽出できそうだし、 そのアドレス（どこのCellか）はこれで抽出できそうだし。 https://exceljet.net/formula/get-address-of-lookup-result

(無題) 削除/引用 No.6935-2 - 2018/05/24 (木) 04:36:25 - mon マクロを作成するのが早いと思います。 「Excel VBA 比較 ファイル」で検索してみてください。

２つのデータ（エクセル）から共通のものを排除する方法 削除/引用 No.6935-1 - 2018/05/24 (木) 04:17:02 - 質量分析 初めてトピックを立てさせてもらいました。 この春、質量分析を私のテーマの中で行うことになり、昨日その結果が出ました。 コントロールIgGで免疫沈降するか若しくは、私の興味のタンパク質に対する抗体で免疫沈降したサンプルに含まれる全タンパク質を質量分析で同定し、その興味のタンパク質と会合するタンパク質を同定することを目的としています。 結果をExcelシートで貰いました。 しかしコントロールとそうでない方とでそれぞれタンパク質が1000ほど検出されており、洗浄の不十分さ、ビーズが多すぎたことなどが問題として考えられます。ですがなんとか今あるデータで埋もれた大事なデータを掬い上げられないかと考えています。 それぞれ1000ほどタンパク質が同定されていますが、あるタンパク質はきっとコントロールの方では見つかっていないはず、そういった操作をExcelのファイルを使って見つけられないか考えています。 ただ方法がわかりません。これに明るい方がいらっしゃればご教授願えませんでしょうか。

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