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(無題) 削除/引用 No.6929-4 - 2018/05/22 (火) 18:54:34 - AP いや、ライゲーションの効率を確かめるため大腸菌に入れたとあるが、GpCメチル化しているDNAはふつうの系統では制限されてしまう。哺乳類のゲノムライブラリーを作るときなんか、メチルシチジン制限系の欠失系統を使わないと生えない。 0.3%という見積が妥当かどうか？ ライゲーションしていないという結論は正しいか？

(無題) 削除/引用 No.6929-3 - 2018/05/22 (火) 18:49:54 - あすかルビー 大腸菌に入れてしまうと、特定のCpGサイト以外もメチル化されてしまうため、大腸菌には入れずに環状DNAを増やしたいのです。 何かいい方法をご存知ないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6929-2 - 2018/05/22 (火) 18:37:24 - AP その宿主大腸菌は、それなりの系統なんでしょうな？ つまりメチルシトシンの制限系が欠失している。

部位特異的にメチル化したベクターの作り方 削除/引用 No.6929-1 - 2018/05/22 (火) 09:41:57 - あすかルビー 目的遺伝子のプロモーター部分を組み込んだルシフェラーゼベクターがあるのですが、そのプロモーターの特定のCpGサイトだけがメチル化したベクターを作りたいです。 今現在、論文を参考にして以下のようにして試みています。 Herculase �U fusion DNA polymelaseとTaq DNA ligaseを用いてPCR-ligation反応を行い、環状DNAを合成 ↓ 精製 ↓ Dpn�TおよびT7エキソヌクレアーゼで鋳型プラスミドを消化 ↓ 精製 ↓ Dnmt�Tで相補鎖をメチル化 しかしPCR-ligation反応のところで、増幅はされるのですがほとんどライゲーションしません。PCR産物を大腸菌に形質転換してライゲーションの効率を調べたところ、環状になるのは増幅産物全体の0.3%程度です。プライマーはメチル化されいる他、ライゲーションするために5‘末端がリン酸化されたものを使用しています。 PCRとライゲーション反応を同時に行うから効率が悪いのかと考え、PCR産物を精製して平滑末端のライゲーションに特化した別のligase（Blunt/TA ligase Master Mix）を用いてライゲーションしてみましたが、うまくいきません。 改善点もしくは他に何かいい方法はないでしょうか。 ご教授お願いします。

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