お世話になります。
現在、培養細胞を用いまして、あるリン酸化酵素特異的な阻害剤を作用させ、ツニカマイシン処理後の、その下流分子のシグナリングが消失するかどうかにつき、検討しています。
そのリン酸化酵素がリン酸化する基質は知られています。
またその基質をリン酸化する酵素は唯一です。
その阻害剤は製薬企業でもともと開発されたもので、非常に特異的です。
これまで私は阻害剤を扱う実験はしてきませんでした。
ここで問題なのですが、培養細胞なので1時間でも阻害剤を加えておいたら効くだろうろ思い、1時間（と念のため4時間）作用させました。ですが、ツニカマイシン処理による下流分子のシグナリングは遜色なく動いているようでした。
そこで質問させていただきたいのですが、培養細胞への阻害剤添付時間として、4時間で不十分ということはありえますでしょうか？あるいは、濃度ももう少しあげた方がいいのかもしれませんが、一応20uMで処理しています。40だと2日後に死にますので、20で行いました。40で12時間や24時間でも死ぬかどうかはわかりません。（死なない気がします）
培養細胞ってそこまで阻害剤処理、必要でしょうか？
もちろん可能性として、
阻害剤が死んでいる
その基質をリン酸化する酵素は他にもあり、その酵素はこの阻害剤では阻害されない
などなど。
ですが、一般論として、培養細胞への阻害剤処理時間は、阻害するタンパク質にも寄ったり、細胞にも寄ったり、阻害剤にもよったりするのでしょうか？素人的な発想では一時間で十分な気がします...培養細胞ですし。 |
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