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(無題) 削除/引用 No.6926-6 - 2018/05/21 (月) 15:59:48 - 774 NL43などのInfectious cloneのEnvを感染者のEnvと入れ替えて複製を調べるべき。と思ったけど、 結局single roundの感染系で感染性を調べないといけないんで、現状の評価系はわかりませんが、 多分似たような方法なんでしょう。 ちょっと考えちがいしてました。すみません。

(無題) 削除/引用 No.6926-5 - 2018/05/21 (月) 00:24:57 - 主 774さん 知識不足で申し訳ないのですが、Infectious cloneに入れて確認とは、 どのような手法なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6926-4 - 2018/05/21 (月) 00:18:08 - 主 おおさん > その上清にウイルスが存在することはどのように確認してますか？ 上清にウイルスが存在することは、2つの方法で確認しています。 �@NL4-3の分子クローンのenvを用いて同様の方法でウイルス作製し、ルシフェラーゼ値の確認 　　このウイルスのルシフェラーゼ値は数十万の値で出ています。 �Ap24の濃度確認 　　ウイルスのコアタンパク質p24の濃度を確認し、この値は十分得られています。 > 患者さんにあるウイルスは変異が蓄積してるんだろうなと思われるのですが、その中の一つのクローンをゲノムからとってきて、たまたま変異で活性がなくなったものを見てる可能性は考えなくっていいのでしょうか？ おっしゃる通りです。 DNAは何度か抽出を行い、その都度クローニングを行った後、感染性を確認してみています。 しかし、一度感染性が得られたものでも、少し時間を開けるとルシフェラーゼ値が下がってしまいます。 理論上、-80℃の保存で半年から1年は安定であるはずなのですが...

(無題) 削除/引用 No.6926-3 - 2018/05/20 (日) 12:23:39 - 774 env発現ベクターからの発現がないか、そのEnvに機能がないか。 最終的にはInfectious cloneに入れて確認しないといけなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.6926-2 - 2018/05/20 (日) 06:14:28 - おお その上清にウイルスが存在することはどのように確認してますか？ 患者さんにあるウイルスは変異が蓄積してるんだろうなと思われるのですが、その中の一つのクローンをゲノムからとってきて、たまたま変異で活性がなくなったものを見てる可能性は考えなくっていいのでしょうか？

HIVシュードウイルスの感染性が得られません。 削除/引用 No.6926-1 - 2018/05/19 (土) 19:15:00 - 主 現在、HIV患者のPBMCから抽出したDNAのenvを目的遺伝子として、シュードウイルスの作製を行っています。 ウイルスの作製はLenti-x 293T細胞に、パッケージングプラスミドと目的EnvプラスミドをFugeneを用いてコトランスフェクションし、上清を回収しています。 その後、ウイルスはU87.CD4.CXCR4またはU87.CD4.CCR5にinfectionしています。 感染性の測定は、ルシフェラーゼ値で見ているのですが、Positiveとして用いているenvプラスミド由来のウイルスに比べると、全く値が出ません。 ウイルスは-80℃で保存し、融解させてから使用しています。 もちろん一度融解したものは、廃棄しています。 ウイルスの作製後にエンベロープが逸脱するといったことは、考えられるのでしょうか。

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