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なるほど 削除/引用 No.6925-9 - 2018/11/01 (木) 15:26:30 - ｓｈ素人+asanの弟子 >asan 師匠 確かにMission-shRNAのヘアピン領域がXhoIで切断できる配列は この時に便利なのですね。 >shRNA素人 師匠 PCR早速試してみますが、asan師匠が言われるように切断後に両端を読みに行くプライマーとしても使えそうですね。 早速のご回答ありがとうございます！！ 大変参考になります。ぜひ試してみます。

(無題) 削除/引用 No.6925-8 - 2018/11/01 (木) 11:21:16 - asan そもそも、”読めない”という状況は色々な原因があるので、単にそれだけだとコメントしづらいですよ。 増幅用PCRプライマーは増幅用ですから、できればshRNAなどの解析用にはそれ用のPrimerを適切な位置に設計しておく方がベターです。 また、ヘアピン構造ができるので頑張っても読みづらいことは有名な話で、それを回避するために例えばsigmaのshRNAオーダーのようにヘアピンに制限酵素サイトを入れておいて切ってから前後で読むなどの方法をとる人もいます。 https://www.eurofinsgenomics.jp/media/29305/seqトラブルシューティング2014oct.pdf

(無題) 削除/引用 No.6925-7 - 2018/11/01 (木) 09:57:27 - ｓｈRNA素人 pLKO-seq-F-358bpccgagggcctatttcccatg pLKO-seq-R-358bp ctttcccctgcactgtaccc これで、PCRしました。 ExTaqで　94-55-72 で　増幅できます。 PCRプロダクトをカラム精製後、増幅プライマーをそのまま シーケンスプライマーとして使用しました。

(無題) 削除/引用 No.6925-6 - 2018/11/01 (木) 08:47:11 - ｓｈ素人の弟子 ｓｈ素人さま、同じ問題で苦労していて興味深く読ませていただきました。 具体的にはどの程度の部分をPCR増幅したら読めたのか ぜひ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.6925-5 - 2018/06/03 (日) 16:11:49 - ｓｈRNA素人 お世話になっております。 結局、ターゲット領域をPCR増幅し、ゲル抽出精製したものをシークエンスに出したら読めるようになりました。 それでもshRNA部分はシグナルが弱かったです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6925-4 - 2018/05/19 (土) 05:35:31 - おお >shRNAはヘアピン配列があるのシークエンシング反応がしにくいです。 ヘアピンのまえまでは読めそうな気がするのですが、、、質問者はそこは読めてるのかな？

(無題) 削除/引用 No.6925-3 - 2018/05/18 (金) 21:56:15 - 独り言 shRNAはヘアピン配列があるのシークエンシング反応がしにくいです。 前にもこんなトピックがありました。参考までに。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=642

(無題) 削除/引用 No.6925-2 - 2018/05/18 (金) 19:59:22 - おお ライゲーションがうまく行ってなくって、挿入箇所前後の配列が削れてしまったため、プライマーがアニーリングする場所がないクローンをシーケンスしているとか。

pLKO.1 shRNAベクターのシークエンスが読めない 削除/引用 No.6925-1 - 2018/05/18 (金) 19:20:56 - ｓｈRNA素人 お世話になります。 AddgeneのpLKO.1 puroベクターを使用し、shRNAベクターの構築を試みています。培養癌細胞株でのshRNAが目的です。 施設はp2の基準を満たしており、組み換え実験も機関の承認を得ています。 santa cruzから購入したウイルスベクターで何度もshRNA導入細胞株を樹立したことはありますが、自分でオリゴを導入することは初めてです。 オリゴの配列はGPP Web Portalというところから引用させていただきました。 「TRCN」というナンバーで管理されているものです。 EcoRIとAgeIに組み込みます。 オリゴを組み込み、miniprepを行い、 正しいオリゴが組み込まれているか確認する作業を行っています。 Addgeneのプロトコールに従ってプライマーを注文しました。 シークエンスは外注でお願いしているのですが、今のところ、シークエンスが読めない現象が続いています。 読めるコロニーもあるのですが、それはすべて導入に失敗しているものでした。 5% DMSO添加を行う、1Mベタインの添加を行うなどしましたが改善されません。 このような現象はよくあることなのでしょうか。 今までプラスミドの構築は何度も行いましたが、ここまでシークエンスが読めないことは初めてです。 Addgeneにも　「pLKO.1はシークエンス条件を検討する必要がある」とのことが記載されています。 恐れ入りますがアドバイスいただけましたら幸いです。 何卒よろしくお願いします。

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