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(無題) 削除/引用 No.6918-27 - 2018/05/23 (水) 06:58:12 - タンパク初心者 おお様、ありがとうございます。 ですよね... 機能的ではない（構造がおかしな）融合タンパク質はGSHビーズには結合しない、というのであればいいのですが、何でもかんでもくっついている状況で途方にくれてしまいます。 ちなみに0.5mgを以前に精製した際には、それを10pmol使って既知のリガンドが組織抽出液からプルダウンされることは確認できています。

(無題) 削除/引用 No.6918-26 - 2018/05/23 (水) 06:11:14 - おお >デタージェントで可溶化した分画にあるGST融合タンパク質だからといって、機能的である保証はないですよね？ それは具体的にアッセイなどしないと確実なことは言えないと思います。例えば既知の結合するとされているタンパク質との結合を確認して見るのは手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.6918-25 - 2018/05/23 (水) 05:47:09 - タンパク初心者 おお様、ありがとうございます。 なるほど、では実際そのタンパク質をアフィニティクロマトとして使う前までは、イミダゾールで溶出した状態で-80度保存しておいた方がいいかもですね...それで使用の度に解凍し、GSHビーズと混和精製をそこで行い、その後すぐにライセートを加えたら良いということでしょうか。 ただGSHビーズに結合しているのか、それともアグっているだけなのでそのタンパク質は機能的ではない可能性もある気がします。。 デタージェントで可溶化した分画にあるGST融合タンパク質だからといって、機能的である保証はないですよね？それとも可溶化したものは翻訳後修飾を必要としないのならば、まず正しい構造をとり、機能的である、と考えて差し支えないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6918-24 - 2018/05/22 (火) 14:16:48 - おお >GSHで溶出後、濃縮およびbuffer交換をしたいのですが、その場合にはアミコンフィルターでやれば大丈夫でしょうか・・・ 得られた蛋白をグルタチオンビーズにつけてプルダウンを考えているなら、Niカラム溶出後デタージェントなどをくわえグルタチオンビーズにつけて、Lysateで使われるバッファーで洗ってそのままLysatesを加えればいいのでは？ 得られた一部のビーズをLysateを加える前に分けておいて、そこから直接サンブルバッファーとかで溶出してInputとして示す（確認する）といいんじゃないかと。

(無題) 削除/引用 No.6918-23 - 2018/05/22 (火) 13:26:49 - タンパク初心者 おおさまありがとうございます。 私の勘違いでした。 デタージェントはそこで改めて加えるということですね。 GSHで溶出する際にもdetergentはそうなると必須ですよね？ GSHで溶出後、濃縮およびbuffer交換をしたいのですが、その場合にはアミコンフィルターでやれば大丈夫でしょうか・・・ >[Re:22] おおさんは書きました : > >以上のことから、私の問題はGSHで溶出以前に起きているものと推察します。 > つまり塩や界面活性剤をGSH溶出バッファーに入れることを検討する以前の問題といいますか、 > > 言ってることがよくわかりませんが、ニッケルビーズから溶出した溶液にデタージェントなど加えてからGSTカラムに吸着すればいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.6918-22 - 2018/05/22 (火) 12:56:04 - おお >以上のことから、私の問題はGSHで溶出以前に起きているものと推察します。 つまり塩や界面活性剤をGSH溶出バッファーに入れることを検討する以前の問題といいますか、 言ってることがよくわかりませんが、ニッケルビーズから溶出した溶液にデタージェントなど加えてからGSTカラムに吸着すればいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.6918-21 - 2018/05/22 (火) 09:50:38 - タンパク初心者 mon様、お世話になります。 ニッケルカラムから溶出する際は、粘性は気にはならないくらいでしたので、うーん、という感じです... 大腸菌でのタンパク質精製はほぼ素人ですので頓珍漢な質問かもしれませんが、一つお聞きしてもよろしいでしょうか？ 私のタンパク質は翻訳後修飾を必要としないタンパク質です。そのため大腸菌で作製しており、過去に他のグループから大腸菌で作製されたこの組替えタンパク質と、そのリガンドとの結晶解析はすでに報告されています。 そこで私も大腸菌で、と思ったのですが、リゾチームや界面活性剤なので得られた所謂、可溶性画分に来る組替えタンパク質は、ほぼ機能的でただしい構造を取るタンパク質と考えてもいいのでしょうか？もちろん不溶性画分（封入体）では機能的ではないというのは知っています。可溶性画分に出たからと言って、（少なくともGSTタグは）機能的な構造を取っているというのは早とちりなんでしょうか？？ 今もう一度大腸菌を増やしてみて、GST精製を先に、その後ヒス精製を試してみようかと思いますが、可能性は低いですよね... >[Re:20] monさんは書きました : > 500mMイミダゾールとタンパクの粘性でないのかな？

(無題) 削除/引用 No.6918-20 - 2018/05/22 (火) 08:32:11 - mon 500mMイミダゾールとタンパクの粘性でないのかな？

(無題) 削除/引用 No.6918-19 - 2018/05/22 (火) 04:01:38 - タンパク初心者 おお様、いつも勉強させていただいております。 この度はお世話になります。 ＞考えられる可能性はイミダゾールがアルギニンなどと同じタンパク質の安定化に寄与してるといわれていて、グルタチオンビーズを洗うときイミダゾールが抜けるからかもしれません。 おお様が以前に言われたこの記述に関してですが、そうは思えないんです。 というのも、500mMイミダゾール（リン酸バッファー）で溶出したものへ、PBSで平衡化したGSHビーズを加えて優しく転倒混和（オープンカラム内で転倒混和しています。もちろん爪が折らず、蓋をしっかりしています。）し、室温一時間もしくは4度一晩後、爪を折って、フロースルー分画を流し出す際にすでに流速は遅くなります。30秒-1分に一滴というくらいです。この時点では500mMイミダゾールはありますので、それらが安定化（フォールディング）に関わるのならば、フロースルーを流し出す工程ではカラムが詰まることはないのではと思います。。 以上のことから、私の問題はGSHで溶出以前に起きているものと推察します。 つまり塩や界面活性剤をGSH溶出バッファーに入れることを検討する以前の問題といいますか、なぜフロースルー分画が綺麗に溶出されないのだろうかというところに問題があると思われます... 実はこのタンパク質、今は大腸菌可溶性画分をニッケルビーズ、そしてその後GSHビーズにとタンデム精製しています。ただ数ヶ月前に0.5mgを精製できた際には、GSHビーズを先に、そしてその後ニッケルビーズで精製していました。ここのフォーラムでニッケル精製を先にした方が良いと拝見しましたので、それにならって います。 あと以前と異なる点として、今回全ての工程で50mMリン酸150mM塩（pH8）バッファーを使っているということです。以前0.5mgを精製できた際には、全て50mMトリス、150mM塩（pH8）を使っていました。これらが理由になり得ることはあるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6918-18 - 2018/05/22 (火) 03:45:52 - おお ５００mMイミダゾールは一般のプロトコールより高いです。ただ私は使うこともあるので問題視してはいません（これでトラブルが合った人がいるなら意見をいただけるとうれしいです）。 起こってそうなことと、解決方法になり得る事は前に述べてますが、他の方法を考えているのでしょうか？ 時間があれば具体的に書いてみますが、、、

(無題) 削除/引用 No.6918-17 - 2018/05/21 (月) 23:42:47 - タンパク初心者 monさん、 500mMはこれまで他のタンパク質でも行って来た濃度です。 おっしゃる通り、やはり高すぎるかもしれませんね...。 ただそれでこれまで問題はなかったので、うーん、どうしたもんか...と行き詰まっています... なぜ流速が極端に落ちるのでしょうか...

(無題) 削除/引用 No.6918-16 - 2018/05/21 (月) 18:10:57 - mon 500mMイミダゾールですよ。濃いのは。

(無題) 削除/引用 No.6918-15 - 2018/05/21 (月) 16:41:24 - タンパク質初心者 >[Re:14] monさんは書きました : > 500mMイミダゾール in 50 mM Sodium Phosphate bufferで、グルタチオンビーズが縮んでいるのかなあ。未使用ビーズでも同じことが起こるなら可能性大。 > 3~5倍程度のDDW or 20mM Tris-HCl buffferで希釈したらどうか。。 monさん、ありがとうございますm(_ _)m ビーズが縮む？！ですか？、、、 50mMでは高すぎるのでしょうか、、、 今回、ニッケルの後にGSH精製というタンデム精製のデザインなので、全てリン酸バッファーにしていますが、GSH精製の場合、トリスを使うことの方が一般的なのでしょうか？ 明日、未使用ビーズにバッハァーのみ混ぜてどうなるか調べてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6918-14 - 2018/05/21 (月) 14:44:08 - mon 500mMイミダゾール in 50 mM Sodium Phosphate bufferで、グルタチオンビーズが縮んでいるのかなあ。未使用ビーズでも同じことが起こるなら可能性大。 3~5倍程度のDDW or 20mM Tris-HCl buffferで希釈したらどうか。。

(無題) 削除/引用 No.6918-13 - 2018/05/21 (月) 14:35:20 - タンパク初心者 みなさま、この度は大変お世話になっております。 改めて、正しい実験材料を使って、何か疑問で、何を質問したいのか書かせていただきました。 先週末から原因究明に乗り出し、還元型グルタチオンのpHもトリスで調製し直し、再度大腸菌から精製に取り掛かりました。 まず、1.5L分の大腸菌培養から得られたペレットを20mlで十分に可溶化しました。可溶化は問題ないです。 そこへニッケルビーズを加え、4度で5時間転倒混和させました。 その後、500mMイミダゾール in 50 mM Sodium Phosphate buffer (pH8.0)で溶出しました。 溶出も問題なしです。 その後、分画1-5を合わせ（計5 ml）、そこへPBSで平衡化したGSHビーズ（300 ul）を加え入れ、新しいディスポのオープンカラム内で転倒混和させました。 その後、オープンカラムの爪を折り、まずはフロースルー分を流しだそうとしましたら、やはり流速が極めて遅いことに改めて気付きました。その後、5カラムボリュームのリン酸バッファーで洗ったのち、25mMグルタチオン（pH8をチェック済み）で溶出を行いました。 確かに分画1-2付近にモノが溶出されますが、ただ、ビーズをその後SDSサンプルバッファーでボイルすると、確かにグルタチオンビーズに残っていることがわかりました。 質問ですが、なぜグルタチオンビーズを加えると、流れが極端に遅くなるのでしょうか？ タンパク質がGSHビーズ表面に結合することで滑らかな（？）流路が形成されないのでしょうか？ ニッケル精製だけでは不十分で、まだもう少し精製したいです。 その後、精製できてしまえば、グルタチオンビーズを使ってアフィニティクロマトグラフィを作りたいんです...。ニッケル精製後、GSH精製ではなく、イオン交換で精製できるとこのトピックでご提案いただけましたが、経験はありません。それはそれで勉強するとして、GSH精製は諦めた方がいいでしょうか？もし諦めて、イオン交換で精製できたとして、その精製物をGSHビーズに付け、アフィニティクロマトグラフィを作ることは可能でしょうか？ 大変初歩的な質問で恐縮しております。 周りに意見を伺うことができないので、どうかご意見いただけますと幸いです。 宜しくお願い致します。

原因判明！？ 削除/引用 No.6918-12 - 2018/05/21 (月) 02:10:16 - タンパク初心者 お世話になります。 昨晩、再度精製を行いました。 ニッケルビーズ→上手に精製できています。十分のタンパク質が溶出されました。ただ、まだ純度は低いです。 グルタチオンビーズ→25mMグルタチオンで溶出しようとするとまた急にオープンカラムからの落下速度が下がりました。 pHはトリスで調節したはず、、、と思っていても念のため、pH試験紙で測定すると酸性を示していました................ そこでいつもの要領でトリスを加えると中性付近に試験紙は変わりましたので、まず、溶出バッファーのpHが間違っていたことが判明しました。これが原因でしょうか？ pHを調節したもので再度溶出を試みようとしていますが、すでにタンパク質は壊れてしまっているでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6918-11 - 2018/05/18 (金) 14:29:55 - タンパク初心者 おおさん 何度も見てくださり、ありがとうございます。 >厳密にそれを確認したという実験を私は見たことがないのでなんとも言えません。不溶化するということはアグルということで、周りのものにべちゃべちゃとくっつきやすくなっているので、ゲルの支持体にもくっついているでしょう。 > もしサンプルを乗せたときスムーズに流れているならその時点ではあまり不溶化してなくって、グルタチオンとのアフィニティーで結合している可能性が高いです。 なるほど。納得です。ただGSHビーズに結合しなかったフロースルーにはほとんどありませんので、おおさんのおっしゃられる通り、その時点ではグルタチオンビーズに特異的に結合しているものと考えます。 > 考えられる可能性はイミダゾールがアルギニンなどと同じタンパク質の安定化に寄与してるといわれていて、グルタチオンビーズを洗うときイミダゾールが抜けるからかもしれません。 この可能性は高いですよね・・・やはりイミダゾールにそのような凝集阻害作用があるのですね。。参りましたね。。 > 界面活性剤存在下でGSTプルダウンアッセイするのはだめなんでしょうか？ 大丈夫です。プルダウンアッセイのサンプルはどのみち細胞ライセートなので問題ないです。 > どちらも、特に塩濃度は反応溶液に加えて希釈したときに許容範囲に収まっていればいいとは思いますが。界面活性剤は除去用のキットがありますが、実際の使用経験はないので解説は経験ある人におまかせしようかと思います。 > > 塩も生化学的には何種類かやれることはありますが（ゲルろ過、透析など）、それによって不溶化ということもあるかもしれません。 明日、もう一度、nickel精製したものにDTTを加えず、GST精製してみます。 その際はスモールスケールで行い、おおさんやWinter-8さんからご指摘いただいたテクニックを使い、どの方法で可溶化されたものが溶出されるか検討してみます。 一つ思い出したのが、実はnickelビーズからイミダゾールで精製したものに1mM DTTを加え、GSHビーズと数時間4度でローテーションしたものをオープンカラムに注ぎ込むといつもならスーッとフロースルーが出てくるのですが、ややつまり気味でした。おかしいな？と思った記憶がありますので。てことはimidazole 500 mM存在下でもなにかしら凝集が始まっていたのか、それとも気のせいか・・・ですね。 一度まず行ってみて、また結果をお知らせさせてください。 この度は初心者にこのようにご親切にしていただき、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6918-10 - 2018/05/18 (金) 12:37:27 - おお >ただ、本当にグルタチオンビーズに結合していたのか、それともただ不溶化していてビーズとの結合は無い 厳密にそれを確認したという実験を私は見たことがないのでなんとも言えません。不溶化するということはアグルということで、周りのものにべちゃべちゃとくっつきやすくなっているので、ゲルの支持体にもくっついているでしょう。 もしサンプルを乗せたときスムーズに流れているならその時点ではあまり不溶化してなくって、グルタチオンとのアフィニティーで結合している可能性が高いです。 考えられる可能性はイミダゾールがアルギニンなどと同じタンパク質の安定化に寄与してるといわれていて、グルタチオンビーズを洗うときイミダゾールが抜けるからかもしれません。 ＞高濃度の塩や界面活性剤を加えるといいかもしれないとありますが、加えることで溶出が可能になったとして、その後そのタンパク質を塩や界面活性剤を加えないでダウンストリームの実験に使えますかね？ 界面活性剤存在下でGSTプルダウンアッセイするのはだめなんでしょうか？ どちらも、特に塩濃度は反応溶液に加えて希釈したときに許容範囲に収まっていればいいとは思いますが。界面活性剤は除去用のキットがありますが、実際の使用経験はないので解説は経験ある人におまかせしようかと思います。 塩も生化学的には何種類かやれることはありますが（ゲルろ過、透析など）、それによって不溶化ということもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6918-9 - 2018/05/18 (金) 12:06:10 - タンパク初心者 Winter-8さん 箇条書きにしていただきありがとうございます。 1. 本当にグルタチオンビーズに吸着してしまったのかを確認する。 ビーズ丸ごとSDS-PAGE、尿素で可溶化など はい、グルタチオンビーズにSDSサンプルバッファを加え煮沸処理すると、確かにそれは溶出されました。 ただ、本当にグルタチオンビーズに結合していたのか、それともただ不溶化していてビーズとの結合は無いという可能性もなきにしもあらずです。ただ、イミダゾールでは綺麗に溶出されています。。 2. GSTを使わずに精製する His-tagではできているのだから、あとはイオン交換などで精製できるはず。なんらかの夾雑タンパク質が凝集をもたらしている可能性がある。 イオン交換はそれほど経験はありません...。イミダゾールのみで溶出したものはそれなりに綺麗にはなっていますが、それでも他にいくつかバンドが出ています。これらはイオン交換で除けるものでしょうか？その場合、陽イオン交換か陰イオン交換かをまず選び、その後、pHや塩の濃度を検討するという予備実験が必要と考えられますが、興ざめなことを言ってしまい恐縮ですが、それで凝集する可能性は低いのでしょうか？？ 3. 精製したタンパクを使って、プルダウンアッセイが可能かどうか検討する 必要最小量の目的タンパク質を使って試してみては？それでも凝集するようならば、もう一度ここで相談してみてはどうでしょう？ GSTビーズに結合させてのプルダウンアッセイは可能でした。 実はこのタンパク質は数ヶ月前に大腸菌の可溶性画分から精製された実績のあるものです。その場合にもGST、His6タグを利用したタンデム精製を行いました。なので、今回、GSHビーズで凝集するというのには、え？どうして？という思いです。 Winter-8さん的には、Ni精製では凝集せず、GST精製で凝集する理由はどう考えられますか？ 実はNiビーズから500mMイミダゾールで溶出し終えたサンプルに、今回初めて1mMのDTTを加える、ということをしてしまいました。（前回0.5mgを精製できた際は加えてはいません。）なぜ加えたか？ですが、GEのホームページに1-10mMのDTTはGSHビーズへの結合を増加させるかもしれない、と書かれていたからです。 次回は加えないようにしようと考えています。。

(無題) 削除/引用 No.6918-8 - 2018/05/18 (金) 10:03:05 - Winter-8 一度にいろいろ悩むと大変なので、順番に片付けた方がよいです。 1. 本当にグルタチオンビーズに吸着してしまったのかを確認する。 ビーズ丸ごとSDS-PAGE、尿素で可溶化など 2. GSTを使わずに精製する His-tagではできているのだから、あとはイオン交換などで精製できるはず。なんらかの夾雑タンパク質が凝集をもたらしている可能性がある。 3. 精製したタンパクを使って、プルダウンアッセイが可能かどうか検討する 必要最小量の目的タンパク質を使って試してみては？それでも凝集するようならば、もう一度ここで相談してみてはどうでしょう？

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