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(無題) 削除/引用 No.6900-6 - 2018/05/18 (金) 00:48:09 - asan そもそも抗体抗原反応でGAPDHがネガコンで出てくるのはWashが甘いというよりも、IPのライセートを持ち込んでるケースが多いかと思います。ビーズに吸着するようなタンパク質の場合はそもそもビーズにアフィニティがあるのだから抗体ー抗原反応とのSN比の問題なので、ポジコンでつくけど吸着でつかない程度にできるだけきつくWashをするに限ります。この辺はWBのブロッキングに考え方は似てるんじゃないかと思います。 Washはビーズが沈んだままテキトーにやってるのは論外ですが、5-6回しっかり転倒混和で一度撹拌するというのはごく普通のやり方でしょう。4℃で長くくらいなら回数を増やした方がバックは減ると思います。 チューブへの吸着による持ち込みをさける意味でも最後の1回のWashの前に新しいtubeに移すと良いです。 ちなみにどんなにWashをしっかりやって、ペプチド溶出しても質量分析で結合分子を全体でとるとよくわからない骨格系タンパク質が500種類ぐらいヒットするので、その手のバックグラウンドは絶対にあると思った方がいいです。IPのビーズのWashなんてのその程度の雑なものです。要はS/N比です。

(無題) 削除/引用 No.6900-5 - 2018/05/07 (月) 02:32:52 - IP+biginner みさん、ありがとうございます！ リパバッファーで洗浄していますので、数分くらいは転倒混和をしようと思います。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.6900-4 - 2018/05/07 (月) 02:31:38 - IP biginner おおさん、ありがとうございます！ おおさんは混ぜたらすぐに遠心派なのですね。 聞いて安心しました。 実は先輩にある論文のデータ（銀染色）を見せられました。 一つ目のレーン：グルタチオンビーズだけで細胞ライセートとまぜまぜ 二つ目のレーン：GSTをグルタチオンビーズに結合させ、そこに細胞ライセートとまぜまぜ 三つ目のレーン：GST融合タンパク質をグルタチオンビーズに結合させ、そこに細胞ライセートとまぜまぜ ビーズを洗浄後、還元型グルタチオンで溶出し、MSの前に銀染色で確かめている図でした。 結果、ほぼ1-3はレーン全体にバンドが認められました。 ただごく僅かに3つ目のレーンでのみ見られるバンドがあり、それを受容体として同定していました（ネイチャーイムノロジー）。 以上のことから、かなりビーズにだけにもベタベタくっつくんだ、ということを学習しました。 なので数分くらいは洗浄をしようかと思います質量分析は感度がたかそうですし。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6900-3 - 2018/05/06 (日) 16:00:21 - み 1-2回では樹脂は底にかなりの量が張り付いたままのことがある。 もちろん液の加え方次第で舞っているかもしれないが。 それにｾﾌｧﾛｰｽ樹脂などはポア内部に蛋白が入り込んでいるんじゃないかな。 樹脂が全部液中に舞っているか観察しつつ最低10回はゆっくり転倒混和してる。 それを3-5回繰り返している。 たまに指でタッピングしたりもする。 界面活性剤の種類の違いに依存して洗浄効率は随分異なる。 SDSを含むバッファーは洗浄効果は強い。 蛋白種類によっては5回繰り返しても非特異にくっついてくるけどね。

(無題) 削除/引用 No.6900-2 - 2018/05/06 (日) 14:34:24 - おお ワークしていればどちらでもいいです。わたしは混ぜたらすぐに遠心などでビーズを回収しています。 ただし、方法論的には私も以前から聞いてみたかったトピックで、じっさいWashのとき５分とか、あるいはもっと長いあいだ３０分とか一時間とかインキュベートをしたりして条件を改善したり試したりした人がいるか、そのばあいの結論や感触はどうだったかなど聞いてみたいとはおもってます。

免疫沈降の洗浄について。 削除/引用 No.6900-1 - 2018/05/06 (日) 12:23:16 - IP biginner 免疫沈降を初めてトライしているものですが、この時の洗浄方法について質問させてください。 細胞のライセートからプロテインGセファロースと抗体を入れ、一晩4度で回転させたのち、遠心して洗浄の操作に入っています。 この時の洗浄バッファーはRIPAバッファーです。 これまで何も考えず、遠心したら、すぐに上清をピペットで吸って捨てて、そこへ洗浄バッファー1ml加えて、1、2回手で転倒混和したらすぐに遠心していました。 ただ、先輩から「洗浄時にはきちんと数分、4度で回転させること。ウエスタンのメンブレンを洗う際にもそうするでしょ」と言われました。ごもっともです。みなさんもそうされていますか？そうするのが普通でしょうか？といいますのも、コントロール抗体で免疫沈降した際にも目的のバンドが検出されていました。そのノックアウト体ではそれは出ないので検出は特異的な抗体です。 トラブルシュートしていた際に、先輩から上記のように言われ、ああ、確かにそうだ。と思った次第です。 実際数分ローテーションさせることは基本なのでしょうか？ ご意見聞かせてください！

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