いつも勉強させてもらっています。
今、あるプロテアーゼのC末にV5-GFPタグを付け、293TやCOS7に一過性導入させました。
抗V5抗体を用いた免疫染色の結果、プロテアーゼの局在は期待通りでした。（免疫染色）
またプロテアーゼの基質も、WTのプロテアーゼを一過性導入した場合には切断され、機能欠失変異を持つプロテアーゼ変異体の場合には期待通り切断されませんでした。（機能assay）
その後、抗V5抗体を用いてwestern blottingを行うと、100-120 kDaを予想していましたが、そのあたりには全くbandは見えず、1-2時間のX-filmへのover exposureにより35 kDaあたりにかろうじてV5陽性のbandが認められました。V5のポジコンとして、V5-GFPを発現させたものでは28 kDa付近に5秒のexposureでも検出可能な強いV5-GFPに由来するbandが認められたので、transfectionやV5抗体は問題ない、という結論になります。
ただ、プロテアーゼ-V5-GFPがwesternで検出されません。。プロテアーゼに対する抗体でもwesternしてみましたが、V5同様、検出されませんでした。GFPではまだです。
ただ、繰り返しになりますが、免疫染色ではV5抗体で特異的に染まっています。強さもコントロールのV5-GFPと遜色なく免疫染色ではV5が染まります。
免疫染色は4% PFA固定ですが、その場合だと抗V5抗体が認識しやすくなる、などの理由があるのでしょうか？westernは通常のreducing SDS-PAGEです。beta-MEを加え、95˚C, 3 min boilしたものを解析しています。
プロテアーゼなので、発現量が多すぎると細胞にとってよくないことが起こるのかもしれません。そのため発現量が低い状態が維持されているのかもしれません。ただ、免疫染色では強くV5特異的な染色像が予想通りの場所に認められるんです・・・このようなことはあり得るのでしょうか？（免疫染色では発現が確認されるが、westernでは確認できないというような。）
わかりづらい文章かと思います。すみません。
コメントをお寄せいただけますと幸いに存じます。
よろしくお願いいたします。 |
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