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(無題) 削除/引用 No.6845-24 - 2018/04/19 (木) 17:16:55 - おお >タンパク質はゴルジ局在で、一型膜貫通タンパク質ですが、 やはりそうですか。ERで合成される蛋白は強制発言するとER内でのプロセッシング、フォールディングなどのキャパシティーを超えて変な結果になったりすることがあるとは聞きます。 もしそうならベクターのプロモーターをかえるとか、トランスフェクションのDNA量を変えるとかでしょうか。わたしはその手の蛋白はあまり使ってないので経験のある方からのコメントがあればいいですね。 >セルライセートは遺伝子導入後48時間で培地を吸引除去、トリプシナイズ、中和、遠心、洗浄後、1％ Triton X100-based lysis buffer plus protease inhibitor cocktailで調製しています。 まずトリプシンを使わないほうがいいと思います。膜表面にない蛋白でもそれで違った結果になったりしますので。 一番細胞内のプロテアーゼのアタックが避けられる方法は一瞬にして変性してしまう方法です。サンプルバッファーなどをつかってLysis後即座にボイルしてしまう。まあその前にトリプシンを使わないで1％ Triton X100-based lysis bufferでやってみてもいいでしょう。protease inhibitor cocktailは念の為上限の濃度加えてもいいかもしれませんロッシュのやつならEDTAが入ってないなら一粒/１０mlぐらいかな、Yeastで使うぐらいの量入れるといいのではと。EDTA入でもそれくらいの濃度で使えるでしょうけどけっこうEDTA濃度が高くなりそうなのが気になります。

(無題) 削除/引用 No.6845-23 - 2018/04/17 (火) 08:59:21 - どくとる1号 おお様、引き続きありがとうございます。本当に心強いです。 > 800-1000番目のC末はそのプロテアーゼ活性に必要なドメイン（やその一部）を含んでますか？もし違う部分を抗原として作成した抗体があればTryしてみるのも手かもしれません。 分解などのCharacterizationもやっておけば論文としてもいいものになるかもしれません。 触媒部位は200-500アミノ酸と言われています。 このタンパク質はゴルジ局在で、一型膜貫通タンパク質ですが、800-1000番目には細胞外（ゴルジ腔内）ドメインと膜貫通領域からなっています。 これまでに3-4つ（サンタクルズ社が2つ、オリジン1つ、AbClonal1つ）の抗体を試しましたが、1つを除いてどれも過剰発現プロテアーゼにさえワークしませんでした。 クロロキンやMG132ですら分解を止められないものってどういった仕組みで分解されているのでしょうか。。 当初、共発現ということからプロモータの干渉かとも考えましたが、そうではなさそうでした。それに触媒活性を欠失させた機能欠失プロテアーゼですら分解（？）されてしまうのが不思議でなりません。。

(無題) 削除/引用 No.6845-22 - 2018/04/17 (火) 08:36:36 - おお >プロテアーゼは約1000アミノ酸からなりますが、800-1000番目のC末をうさぎに免疫して得られたポリクロです。 800-1000番目のC末はそのプロテアーゼ活性に必要なドメイン（やその一部）を含んでますか？もし違う部分を抗原として作成した抗体があればTryしてみるのも手かもしれません。 分解などのCharacterizationもやっておけば論文としてもいいものになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6845-21 - 2018/04/17 (火) 07:27:33 - どくとる1号 おお様、ありがとうございます。 > その蛋白特異的な抗体でも検出できないということのようですが、その抗体は蛋白のどの部分から抗体を作ってますか？ プロテアーゼは約1000アミノ酸からなりますが、800-1000番目のC末をうさぎに免疫して得られたポリクロです。 > 活性のAssay方法ですが、エンドの活性は検出されますか？される場合はどのように導入したもの特異的な活性を導いていますか（ベースラインとして差し引いているのでしょうか？）。 活性のAssay方法ですが、先ほどの返信にも書きましたが、プロテアーゼのノックアウト体を持っています。 その細胞に既知の基質を過剰発現させるとその基質は切断されませんが、そこに今回のプロテアーゼを共発現させると基質は切断されます。その切断はウエスタンにより容易に検出可能です。なのでノックアウト細胞を用いるアッセイにおいては、エンドの活性は検出されません。このアッセイ方法で今回のV5GFPタグ付きプロテアーゼはきちんと共発現させた基質を切断してくれました。ウエスタンでプロテアーゼやV5抗体では染まらないにも関わらずです。 > 活性は残っているけど、抗体で掛かりそうな部分は分解（切断されてしまっているとか、、、）。 > いちどmyc-FLAGタグで同じ細胞でやってみて見るのも手かと思いますけど、、、 はい、これに関しては行っております。 293T細胞でmyc-FLAGタグつきプロテアーゼの導入によりタグおよびプロテアーゼの抗体での発現は確認できます。 > ではその細胞では分解が促進されている可能性は高いですね。 > Cell lysateはどのようにして調製していますか？Lysateにするプロセスで壊れているのか、細胞内ですでに壊れているのかをある程度見極める必要があるのかもしれません。 そうですね。。ライセート調製中に壊れる可能性は考えたことがありませんでした。 セルライセートは遺伝子導入後48時間で培地を吸引除去、トリプシナイズ、中和、遠心、洗浄後、1％ Triton X100-based lysis buffer plus protease inhibitor cocktailで調製しています。その後デブリを遠心で除去し、上清にSDSサンプルバッファーを加え、95度3分ボイルしたものをSDSページにかけています。

(無題) 削除/引用 No.6845-20 - 2018/04/17 (火) 07:15:45 - どくとる1号 SYK様、ありがとうございます。 情報を小出しにしてしまい、申し訳ありません。 > V5の免染以外に、GFP（ライブの蛍光あるいは抗GFP抗体で免染）の検出や、プロテアーゼそのものの免染でも、同様の細胞内（ゴルジ）局在が確認できますか？ プロテアーゼに対する抗体では免疫染色はしたことがありません。次に行ってみます。ありがとうございます。 > 293TやCOS7は、そのプロテアーゼを内在性に発現していますか？　プロテアーゼそのものに対する抗体でウエスタンすると、内在性のタンパクは検出できますか？　プロテアーゼに対するウエスタンでのポジコンは、どうしてますか？ いずれの細胞でも内在性のプロテアーゼの発現は検出できませんでした。膜分画を回収しても検出できませんでした。プロテアーゼに対するウエスタンのポジコンは、プロテアーゼ-myc-FLAGを293Tに発現させたものを使用しています。この場合、タグおよびプロテアーゼに対する抗体いずれでも検出可能です。 > 35kDのバンドを分解産物と考えるのであれば、これはV5-GFPを含むC末の産物と考えて良いですか？ pEGFP-N1だけを導入した細胞ではV5抗体で検出される35kDのバンドは認められないので、そのように考えています。 > プロテアーゼC末のV5-GFPタグがプロセシングされている可能性を考えます。プロテアーゼに対する抗体でのウエスタンが重要と考えますが、タグが切れてしまうと内在性タンパクとの区別がつかないかもしれないですね（導入遺伝子からの発現量が十分高ければ問題ないでしょうけど）。 そうですね、、ただ内在性タンパク質は検出限界以下ですので、C末が切断されていても、プロテアーゼに対する抗体でプロテアーゼ-myc-FLAGは検出できます。が、プロテアーゼ-V5-GFPは検出できませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6845-19 - 2018/04/17 (火) 07:10:31 - どくとる1号 mon様、AP様、引き続きありがとうございます。 実はこのプロテアーゼとても不思議なんです。 まず、内在性のプロテアーゼの検出は不可能でした。 myc-FLAGタグ付きのタンパク質を293TにPEImaxで発現させると、タグ付き抗体だけでなく、プロテアーゼに対する抗体でも検出できます。 ただ、内在性のプロテアーゼは膜画分でも検出できませんでした。 一方、エレポで不死化B細胞に導入すると、不思議なことに今回同様、myc-FLAGタグ付きにも関わらず、両抗体でも検出できませんでした。コントロールとしてpEGFP-N1の導入効率は6-7割です。 おそらく内在性の発現量は極めて低くコントロールされているのだろうと考えています。 プロテアーゼ欠損細胞を持っています。 この細胞にその基質を過剰発現させると、その基質は未切断のままですが、プロテアーゼを共発現させるとその基質は切断されるようになります。これをプロテアーゼのアッセイシステムとして使用しています。 ただこの共発現の実験に関してですが、基質のプラスミド1に対し、プロテアーゼを0.01の比で導入しないと、基質の切断は見られません。つまり、ほんの少しのプロテアーゼのプラスミドが導入されれば、その基質はほぼ100％切断されることを意味しています。逆にプロテアーゼを1や0.1で共発現させると、基質そのものの検出が不思議と出来なくなります。MG132やクロロキン存在下でも検出できませんでしたので、プロテアーゼやその基質の発現は極めて低くコントロールされており、過剰な発現ではプロテアーゼの積極的な分解？や基質の分解（機能欠失型プロテアーゼを1、0.1導入しても基質は検出されなくなります。）が起きているのではと考えています。

(無題) 削除/引用 No.6845-18 - 2018/04/17 (火) 06:20:24 - おお あ、変異体、Wtでも同じような結果なのですね。 ではその細胞では分解が促進されている可能性は高いですね。 Cell lysateはどのようにして調製していますか？Lysateにするプロセスで壊れているのか、細胞内ですでに壊れているのかをある程度見極める必要があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6845-17 - 2018/04/17 (火) 05:59:59 - おお 免疫染色では分解されていてもエピトープ部位を含む短いペプチドがあれば検出されます。 その蛋白特異的な抗体でも検出できないということのようですが、その抗体は蛋白のどの部分から抗体を作ってますか？ 活性のAssay方法ですが、エンドの活性は検出されますか？される場合はどのように導入したもの特異的な活性を導いていますか（ベースラインとして差し引いているのでしょうか？）。 活性は残っているけど、抗体で掛かりそうな部分は分解（切断されてしまっているとか、、、）。 いちどmyc-FLAGタグで同じ細胞でやってみて見るのも手かと思いますけど、、、 Wtでとか言うくだりがあったような気がしますが、その検出ができないConstructはWtですか？なにか変異体ですか？

(無題) 削除/引用 No.6845-16 - 2018/04/16 (月) 23:12:30 - SYK 了解です。結局、最初のおおさんのコメントに戻るのかな、というのが個人的な印象です。関連して何点か質問させて下さい。 V5の免染以外に、GFP（ライブの蛍光あるいは抗GFP抗体で免染）の検出や、プロテアーゼそのものの免染でも、同様の細胞内（ゴルジ）局在が確認できますか？ 293TやCOS7は、そのプロテアーゼを内在性に発現していますか？　プロテアーゼそのものに対する抗体でウエスタンすると、内在性のタンパクは検出できますか？　プロテアーゼに対するウエスタンでのポジコンは、どうしてますか？ 35kDのバンドを分解産物と考えるのであれば、これはV5-GFPを含むC末の産物と考えて良いですか？ プロテアーゼC末のV5-GFPタグがプロセシングされている可能性を考えます。プロテアーゼに対する抗体でのウエスタンが重要と考えますが、タグが切れてしまうと内在性タンパクとの区別がつかないかもしれないですね（導入遺伝子からの発現量が十分高ければ問題ないでしょうけど）。

(無題) 削除/引用 No.6845-15 - 2018/04/16 (月) 12:33:09 - AP いや待て、エピトープタグとGFPタグじゃ構造、物性に対するインパクトが違いすぎるな。myc, FLAGでokだからGFPでも大丈夫とは言えないな。

(無題) 削除/引用 No.6845-14 - 2018/04/16 (月) 12:28:04 - AP 同じタンパク質で特定のタグをつけたものだけ検出されないという話でしたか。勘違いしてました。

(無題) 削除/引用 No.6845-13 - 2018/04/16 (月) 12:22:46 - AP 他のサイズの大きいタンパク質がトランスファできたからといって、今扱っているタンパク質がそうとは限りません。 セミドライ、20% MeOHだと高分子量はかなり苦手の条件でしょう。 タンクブロット、pHやや高め、MeOH抜き、SDS少々 セミドライ、3液型のバッファーシステム（実験書やATTOなどのガイドにある） など高分量に強い条件があります。 タンパク質の移動が良くなる分、膜には付きにくくなる傾向があるので、PVDFを使用。

(無題) 削除/引用 No.6845-12 - 2018/04/16 (月) 11:55:36 - mon V5抗体がWBに使えないとは思えないのですが、PVDF膜と相性が悪い抗体（どちらかというとタグペプチドの方）はあります。 ニトロセルロース膜が良いかもしれないし、ブロッキング剤を変えると良いかも？？？

(無題) 削除/引用 No.6845-11 - 2018/04/16 (月) 06:37:11 - どくとる1号 SYK様、引き続きお世話になります。 ウエスタンではWTと変異体いずれも100-120kDバンドは認めず、35kD付近の分解物のバンドは等しい強さで認められます。 免疫染色ではシグナルが変異体の方が強いという印象はありませんで、いずれもゴルジ体に局在していました。ウエスタンでの転写効率の可能性はありますね。 >[Re:10] SYKさんは書きました : > 機能欠失変異体のV5-GFPタグでは、免疫染色とウエスタンの結果はどうなりますか？　WTでは低発現細胞が選択されるならば、機能欠失変異では相対的に発現が高くなり、免疫染色でのシグナルがより強くなったり、ウエスタンでバンドが検出できる可能性がありますね。また、機能欠失変異でウエスタンがワークすれば、転写効率やタグの構造によるトラブルの可能性を否定できますね。

(無題) 削除/引用 No.6845-10 - 2018/04/16 (月) 02:25:19 - SYK 機能欠失変異体のV5-GFPタグでは、免疫染色とウエスタンの結果はどうなりますか？　WTでは低発現細胞が選択されるならば、機能欠失変異では相対的に発現が高くなり、免疫染色でのシグナルがより強くなったり、ウエスタンでバンドが検出できる可能性がありますね。また、機能欠失変異でウエスタンがワークすれば、転写効率やタグの構造によるトラブルの可能性を否定できますね。

(無題) 削除/引用 No.6845-9 - 2018/04/16 (月) 00:01:01 - どくとる1号 AP様、PYK様、 すみません、転写というのは遺伝子発現のことだと勘違いしていました。 プロテアーゼV5-GFPのレーンの隣に、プロテアーゼmyc-FLAGを流しています。分子量の違いは20kDほどですが、プロテアーゼに対する抗体ではプロテアーゼmyc-FLAGの特異的バンドは検出されています。 転写はセミドライ式、20％メタノールを含む一般的なトリスグリシンバッファーです。 15V、75分を目安に転写させており、この条件で170kDの他のタンパク質のバンドも検出しています。

(無題) 削除/引用 No.6845-8 - 2018/04/15 (日) 23:56:28 - PYK 転写の条件や、メンブレンの種類など事細かく条件を記載した方が、皆さんのリスポンスがあると思います。 そのプロテアーゼが膜タンパクかわかりませんが、一般的に膜タンパクは95度でボイルするとウェスタンで検出されない傾向があります。その場合、低温（60-70度）でボイルします。

(無題) 削除/引用 No.6845-7 - 2018/04/15 (日) 23:18:55 - AP 転写効率はサイズが大きいほど低下する、タンパク質ごとに異なる(等電点などの影響)ということは頭に置いておくべき

(無題) 削除/引用 No.6845-6 - 2018/04/15 (日) 23:13:05 - AP タンパク質があっても膜に転写されなければ検出されません。 特にサイズが100 kDaを超えるようだとその可能性は高くなります。 トランスファの条件はどういうの？標的の等電点は？

(無題) 削除/引用 No.6845-5 - 2018/04/15 (日) 22:37:28 - どくとる1号 AP様、ありがとうございます。 転写の効率などはわかりませんが、基質が切断されていますので、タンパク質そのものはあるのだと思います。免疫染色や機能アッセイでは期待通りのデータがでていますので、westernではワークしない、というのが理解に苦しみます・・・。

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