BioTechnicalフォーラム [CRISPRによるC末端領域の欠損]

CRISPRによるC末端領域の欠損

No.6829-TOPIC - 2018/04/09 (月) 21:11:37 - ぶぅ

こんばんは。ゲノム編集にトライするのは初めてでわからないことが多く、こちらで質問させて頂きます。

私は今、ある遺伝子のタンパク質コード領域（抗体のエピトープとして用いています）のC末端付近の配列をマウスの配列から別の動物種の配列に編集したいと考えています。（マウス用抗体がどうしても作製できなかったため）

目的の動物種の塩基配列を単純にノックインするだけであるならば、適切な位置にgRNAを設計し、目的の配列をHDRを利用して組み込んであげれば上手くいくと考えているのですが、この場合もとのマウスの配列がゲノム上にはそのまま残ってしまうことが気になります。

残ってしまうマウス本来の塩基配列を完全に欠損させるには、どうすればよいのでしょうか。もしくは、終止コドンを挟んでいるのでゲノム上にマウス本来の塩基配列が残ることに関しては、それ程気にしなくてもよいのでしょうか？

5'- XXXXXXXX【他の動物種の配列】TGA【マウス本来の配列】-3'

説明が的を得ていないかもしれませんが、ゲノム編集後、上のような配列になった場合に、【マウス本来の配列】を狙い撃ちして欠損させることはできるのでしょうか？（欠損させたい塩基数は20bp程になります）

とんちんかんな質問かもしれませんが、お返事が頂けましたら
　

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No.6829-14 - 2018/04/12 (木) 08:40:25 - ぶぅ

お返事が遅くなってしまいました。
沢山のご助言を頂きまして有難うございます。

影響があるかどうかはやってみなければわからないというのが実際のところだと感じましたので、ひとまずは単純に【他の動物種のC末アミノ酸配列】を組み込むような編集にトライしてみようと思います。

編集前と比べて遺伝子発現の程度が大きく変化してしまったような場合には、皆様が提案してくださった方法を参考に内在性遺伝子の3' UTRの配列を再現するような編集に切り替えてリトライしようと思います。

大変勉強になりました。有難うございます。
またご相談させていただくかもしれませんが、よろしくお願い致します！

(無題)

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No.6829-13 - 2018/04/10 (火) 18:58:13 - AP

あとはそこまで面倒くさくて成功率を下げそうなことをやるだけのメリットがどれくらいあるか。苦労した割に、やってもやらなくても対して結果は変わらないようなことかもしれないよ。

(無題)

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No.6829-12 - 2018/04/10 (火) 18:54:52 - AP

>相同組換え修復はべつに切断点付近の配列じゃなきゃダメってことでもないからね。

どんなかたちでドナーDNAを供するのかわからないけれど、線状化したものならそれ自体がDSBをもつのでそれを修復しようとするかたちでHRが起こればノックイン可能だ（昔ながらのgene targettingのように)。

そうでなくても、先ほど提案したように、宿主にゲノムに作ったDSBの片側の末端はドナーを鋳型に直ちに伸長できるけれど、もう一方の末端はドナーと相同ではないけれどもうちょっと先には相同配列がある場合、いくつかのシナリオがある。
まず、相同配列のない宿主ゲノム末端がドナーと相同配列（この場合3' UTR)が現れるまでエクソヌクレアーゼで削られて、相同組換え修復が開始される場合。
そして、もうひとつは、取り合えず末端がドナーと相同な側からHRに伴う複製が起こる。そのまま複製され、この場合ドナー上に組み込んだ3'UTRの配列まで伸びれば、宿主の3'UTRとHRを起こしうる。

ちょっと、説明がうまくないけど。

(無題)

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No.6829-11 - 2018/04/10 (火) 18:38:21 - AP

まあ残っていても顕著な問題は無いと思うけどね。
どうしてもというのなら、ドナーDNAの配列を5'末端側はそのままで（内在性CDSとin-frame）、3'側をStop codonのあとに、内在性遺伝子の3' UTRの配列にすればいいと思う。相同組換え修復はべつに切断点付近の配列じゃなきゃダメってことでもないからね。

(無題)

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No.6829-10 - 2018/04/10 (火) 18:05:03 - おお

＞5'- XXXXXXXX【他の動物種のC末アミノ酸配列】TGA【マウス本来のC末アミノ酸配列】【マウス本来の3'UTR】-3'

＞遺伝子発現の仕組みについて勉強不足かもしれませんが、上記のような心配はないのでしょうか？

それはなんともいえない。
確かにストップコドンのあとにC末の配列が繰り返されるのはちょっと気持ち悪るいというのはわかるけど、ストップコドンのあとはアミノ酸配列が翻訳されてできるわけでもないので、そういう意味では悪さはしないでしょう。

また不自然なゲノム構成になるので

5'- XXXXXXXX【他の動物種のC末アミノ酸配列】TGA【マウス本来の3'UTR】-3'

にしたほうがいいんじゃないかという意見も一理あると思うが、でもちょっと待てと考えてしまう要因がある。アミノ酸配列をコードしている領域にもその他の機能をもったエレメントが存在している可能性があるから。たとえばスプライシングされるときにエクソンに取り込まれるようなエクソン認識配列とか、mRNA安定性に関わる配列とか、miRNAのターゲットの配列とか、mRNAの局在に関わる配列とか。こういうのが他生物種の配列に置き換えてたとき保存されているかどうかいくらかきになる。まああまり考えていても結論がでないものもあるけど。

(無題)

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No.6829-9 - 2018/04/10 (火) 09:24:38 - xyz

>遺伝子発現に何か影響を与えうるのではないか

可能性でいうならば絶対に影響を与えないとは言えません。
なので今回のケースであるならば普通は、単純に目的配列をゲノムに挿入するのではなく、標的配列との置換により考えうる悪影響を排除したゲノム配列を持つ系統を樹立します。

>好都合というのは、【マウス本来のC末アミノ酸配列】と【マウス本来の3'UTR】がゲノム上で連続していることが遺伝子発現上大事だということなのでしょうか？

その通りです。その遺伝子なりの最適化された3'UTRが接続されているはずです。
しかし今回の場合はC末のアミノ酸配列の置換であり3'UTRを改変しなくてもいいので、CDS内で完結するゲノム編集である限りにおいてそのような心配をする必要はありません。

(無題)

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No.6829-7 - 2018/04/10 (火) 07:54:40 - ぶぅ

皆様、ご返信有難うございます。

終止コドンの後ろに【マウス本来の配列】が残ることの懸念点は、xyzさんが仰ってるように、【マウス本来の3'UTR】に余計な配列（マウス本来のC末アミノ酸配列）が入ってしまい、遺伝子発現に何か影響を与えうるのではないかと考えたからです。

5'- XXXXXXXX【他の動物種のC末アミノ酸配列】TGA【マウス本来のC末アミノ酸配列】【マウス本来の3'UTR】-3'

遺伝子発現の仕組みについて勉強不足かもしれませんが、上記のような心配はないのでしょうか？好都合というのは、【マウス本来のC末アミノ酸配列】と【マウス本来の3'UTR】がゲノム上で連続していることが遺伝子発現上大事だということなのでしょうか？

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No.6829-6 - 2018/04/10 (火) 05:30:17 - おお

もう少し考えているデザインを具体的に示せないでしょうか。入れ替えたC末のストップコドンより下流がマウスの配列になることは理想的と思えます。なぜならUTRがその遺伝子の発現の制御に関与している可能性があるので。

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No.6829-5 - 2018/04/09 (月) 23:05:36 - xyz

終止コドンの後ろに残っているマウスの配列は本来アミノ酸をコードしていた塩基配列なので、3'UTRになった結果どのような影響を与えるのか予想できないから気持ち悪い、ということなのでは？

(無題)

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No.6829-4 - 2018/04/09 (月) 22:45:47 - AP

終止コドンの後ろにマウスの配列が残っていることでいかなる不都合が起こると考えているのですか？むしろ3‘UTRやポリA付加シグナルを与えて好都合なのでは？