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(無題) 削除/引用 No.6828-7 - 2018/04/11 (水) 00:19:41 - dest ・コドンを大腸菌にoptimizeして人工遺伝子合成 ・N末端の5,6アミノ酸をAT-richのコドンに変更（SKIK等を入れるのもOK） http://europepmc.org/abstract/med/28052816 https://www.genefrontier.com/downloads/purefrex/ 再構成型タンパク質合成系（PUREfrex）におけるN末端コドン最適化による翻訳効率向上（2016年） 好熱菌のタンパクなら安定性は問題ないと思うので、まずはDNAをいじってみてから考えた方がいいと思います codon optimizeで発現量10倍なんてのもありますからね

(無題) 削除/引用 No.6828-6 - 2018/04/10 (火) 11:03:33 - AP 好熱性細菌由来や哺乳類由来のGC-richは遺伝子が、大腸菌で発現しにくいという現象は古くから知られていて、対応策に関する論文も多く出ていると思います。 GC-richの遺伝子の発現に関してはコドンの入れ替えもさることながら、ORFにある種のリダー配列を入れるといいというのが報告されていて（Ishida et al.)、それを商品化したのがこれ、 http://www.nippongene.com/siyaku/product/dna-cloning/plead-dna/plead-dna.html Tagは自前でつけなければなりませんけれど。 あと、培養温度を振ってみるとか。普通、発現にトラブルがあるときは温度を下げるというのがありますが、それに加えて温度を上げてみるとか（GC-richなので）。

(無題) 削除/引用 No.6828-5 - 2018/04/10 (火) 10:28:05 - mon 一般的にGC含量が多い遺伝子は大腸菌での発現量はかなり少ないです。 カタログデータのような明確なバンドは、異種タンパクの場合珍しいと思った方がよいですよ。またタンパク産生にはLBよりrichな培地(2xTY、TB)等をお薦めします。 おおさんの指摘通り、CBB染色のバンドでは確認できないレベルの発現量なのでしょう。 WBでの確認は必須です。 目的遺伝子産物の酵素活性が大腸菌に毒性がなければ、Auto-Induction Mediumも発現誘導操作が不要なので簡単で良いです。組成はNetで見つかります。

(無題) 削除/引用 No.6828-4 - 2018/04/10 (火) 00:54:51 - おお 発現があなたの検出方法で検出限界以下という可能性はありませんか？WBで検出しないとはっきり検出を確認できないこともあります。

(無題) 削除/引用 No.6828-3 - 2018/04/09 (月) 23:29:22 - たいやき mon様 お返事遅れまして、また重ねましてこちらの説明不足で大変申し訳ございません。 pETのマニュアルについては読んでおりますが、トラブル対応については確認できておりませんでしたので熟読します、、ご指摘ありがとうございました。 また実験操作については以下の通り行いました。 �@ LB 3ml(Amp 6μl、Cm 3μl)、37℃で一晩菌体を振盪培養 �A LB 30ml(Amp 60μl、Cm 30μl)に前培養液�@ 600μlを加え、37℃で振盪培養開始 �BOD値＝0.6〜0.8 A付近でIPTG終濃度＝0.1 mMになるよう添加し誘導を開始させ、ここから3h,5h,24hで菌体を回収（8000rpm、5min、4℃） �C菌体破砕はB-PERとDNase�Tを用い、上清沈殿に分けSDS-PAGEにより発現確認を行った また好塩菌自体GC含量が高く、本実験での対象酵素の目的遺伝子配列においては71%であります。レアコドンの割合は12%でした。 HisタグをN末端につけていますが発現レベルに何か影響しているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6828-2 - 2018/04/09 (月) 19:56:24 - mon 基本的な情報がわからないので答えようがないよ。。 pETのManualを熟読したよね？Trouble Shootingくらいは実行したのか？ 使用した培地（特殊なら組成）、発現確認の方法、培養温度、IPTG濃度等。 さらには、目的遺伝子配列のGC含量。大腸菌マイナーコドンの割合。

好塩菌由来の酵素がタンパク質として発現しない 削除/引用 No.6828-1 - 2018/04/09 (月) 19:29:48 - たいやき 好塩菌由来の酵素について研究しているのですが、未だ発現の段階で立ち往生しています。ベクターはpET19、発現株はRosetta(DE3)、gamiB(DE3)、gami2(DE3)を試しました。IPTG誘導は3,5,24hで試しましたが、どの条件でも発現が確認できていない状態です。 何か参考となる方法がありましたら教えて頂きたいです。

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