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(無題) 削除/引用 No.6791-10 - 2018/03/25 (日) 08:58:26 - ザック おおさん ありがとうございます。仰る様に、C末につけたタグのみの発現を懸念するなら、タグのATGをつぶす方が確実ですね。そのようにします。

(無題) 削除/引用 No.6791-9 - 2018/03/25 (日) 02:03:05 - おお ATGの塩基の一つでも置換されていたら周りがコザック様でも機能しないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6791-8 - 2018/03/24 (土) 16:00:04 - ザック Pさん ありがとうございます。現在、目的遺伝子を特殊なプロモーター下に発現するベクターを既に持っており、今回はそのベクターを改変してタグを入れたいと思っています。なので、あまりプロモーター〜目的遺伝子の部分はいじりたくないと思い、C末端にEGFPを入れることを考えていました。今回は、そのままC末端にEGFPを入れようと思いますが、EGFPをN末端に入れるのは自由度が高いとのこと、次回からの参考にさせていただきます。 > Kozakが入っているのはNcoI, NheIなどの認識配列や、プライマー設計の都合が多いのではないでしょうか。Kozakを入れたまま、ある遺伝子の下流にEGFPを入れ、EGFPが主な発現タンパクになってしまった(目的タンパクはわずか)という失敗を経験しています。 これは嫌ですね。コザックはむしろ削除する方向で考えます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6791-7 - 2018/03/24 (土) 12:33:00 - P EGFP のC末端であれば、ある程度の自由度があり、そのままin frameしても良いと聞いています。私の周りには、EGFP-目的タンパクでやる人が多いです。 目的タンパクのC末端にEGFPを入れるのは、”間違わない、確実”という意味ではいいでしょうが、Kozakなど、発現効率等考えねばならず、面倒では、、、 周囲では、EGFP のC末端にin frameでATGから入れる人が多いです。 Kozakが入っているのはNcoI, NheIなどの認識配列や、プライマー設計の都合が多いのではないでしょうか。Kozakを入れたまま、ある遺伝子の下流にEGFPを入れ、EGFPが主な発現タンパクになってしまった(目的タンパクはわずか)という失敗を経験しています。大腸菌発現ならともかく、真核細胞で発現してダメだったときはガックリです。

(無題) 削除/引用 No.6791-6 - 2018/03/24 (土) 10:50:37 - ザック monさん 非常に詳細に教えていただき、ありがとうございます。 アミノ酸の性質、タンパクの高次構造などはあまり知識がない分野だったので、これを機会に勉強してみたいと思います。 できるだけ導入遺伝子長を短くしたいと思ってはいたのですが、逆にタグ（GFP）により目的遺伝子の機能が干渉されたら元も子もないですし、お教えいただいた内容を参考に、安全そうなリンカーを設計してようと思います。

(無題) 削除/引用 No.6791-5 - 2018/03/24 (土) 06:11:41 - mon リンカーとして好適な（必須ではない）アミノ酸は、親水性＞疎水性、小さい＞大きい、中性＞電荷有り、柔軟（フレキシブル：a-helixやb-sheet構造を形成しない）である事で、その意義は目的タンパクやタグタンパクの高次構造に干渉しないことです。 IgGのヒンジ領域配列やM13ファージg3タンパク由来のグリシン・セリン（・グルタミン酸)リンカーがよく使われるようです。FRETで使われているリンカーも参考になると思います。 タンパクのN末・C末は抗体エピトープとして汎用されることもありフレキシブルな配列になっていることが多いので、リンカー長0〜制限酵素部位由来の2アミノ酸でも機能することも多いとは思います。 使用するアミノ酸としてはグリシン・セリン・プロリン（折れ曲がり）が好ましいですが、(御託を述べた割には）それよりも柔軟性をもつ長さの方が重要だと思っています。 私は、前例がない場合、制限酵素部位導入・フレキシブル配列・PCRプライマーの設計・金額を考慮して6アミノ酸長を目安にしています。9アミノ酸長程度にするや市販抗体のエピトープタグ配列を使う事もあります（後年忘れてWBでアレ？となりますので注意）。いろいろなタンパク（目的タンパク）の高次構造を眺めて、6アミノ酸長ってどの程度かイメージすると良いです。 リンカーをコードするDNA配列の好ましい性質は、タグ・目的遺伝子配列にない制限酵素切断配列を含む、マイナーコドンを含まない、GATC/CCWGGのメチル化配列を含まない等ですが、グリシン・セリンだけだとGC-richでPCR時にミスアニールしやすくやや作製が面倒です。

(無題) 削除/引用 No.6791-4 - 2018/03/23 (金) 23:28:23 - ザック 先ほどの投稿、774Rさんに返信しようとして、間違えて自分の名前を”774Rさん”とする、というバカをやってしまいました。すみません、、、、、

(無題) 削除/引用 No.6791-3 - 2018/03/23 (金) 23:25:58 - 774Rさん ありがとうございます。 やはり、他の遺伝子のC末にGFPを入れているときには、いくらコザックがあったからといって、GFPのATGから翻訳が開始されることは普通はないですよね。（遺伝子の大きさによって、絶対とは言い切れないのかもしれませんが） できるだけコンストラクトを小さくしたくて、無駄な配列は削除しようかと思っていたのですが、確かに目的タンパクとの間に柔軟性はあったほうがいい気もしますし、今回はinfusionを使う予定ですが、制限酵素サイトがあったほうが後々使えることもあるかと思うので、適当なリンカーを検討してつないでみたいと思います。 派生質問で申し訳ないのですが、遺伝子とGFPの間のリンカーとして数アミノ酸程度を入れる場合、どのような制限酵素サイトが使いやすいで良いでしょうか。もちろん、自分の遺伝子との兼ね合いもありますし、アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン等、とヒントもいただいているので、自分で調べるべきところではあるかもしれませんが、皆様の経験もお伺いしたいです。

(無題) 削除/引用 No.6791-2 - 2018/03/23 (金) 17:58:32 - 774R Kozakはおそらく、ネガコンとしてGFP単独で発現させる用途があるからでしょう。 他の遺伝子のC末にGFPを融合する場合は、Kozakは必要ないですよね。そこから翻訳が開始される訳じゃないから。 ただ、目的タンパク質とGFPの間に柔軟性を持たせるためにグリシン、セリン、スレオニン等の数アミノ酸のリンカーを入れることはよくやられてると思います。 制限酵素サイトでつなぐなら、アミノ酸配列がどうなるか意識して選ぶと一石二鳥です。

タグ前のコザック配列 削除/引用 No.6791-1 - 2018/03/23 (金) 17:22:26 - ザック 初歩的な質問ですみません。 pEGFP-N1などのタグつきタンパク作成用のプラスミドで、MCS（マルチクローニングサイト）とタグの間にコザック配列があるのをしばしば見かけます。 (つまり、---MCS-コザック-EGFP---) このコザック配列は、MCSに任意の遺伝子を挿入していない場合にのみ効いている、つまりコントロールとしてナイーブなpEGFP-N1などを使おうとする場合でもちゃんとEGFPが発現するように存在している、という理解でいいのでしょうか？ もしくは逆に、MCSに遺伝子を挿入している場合でも、コザックが効いて、EGFP単体での発現もしやすくなっていたりするのでしょうか？ pEGFP-N1からEGFP部分をPCRでとってきて、別のプラスミド内の遺伝子のC末にinfusionで挿入しようと思っているのですが、コザック配列抜きでEGFP遺伝子のみを入れ込むのが良いのか迷ったため、質問させていただきました。 （目的は、遺伝子を導入できた細胞を確認するためにEGFPを入れる予定で、遺伝子の局在をタグで見たいわけではありません。導入遺伝子長の関係もあり、IRES、P2Aは使わないつもりです） よろしくお願いいたします。

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