最近プラスミド関連の投稿が多いなと思いつつ、明日はわが身で、私もプラスミド構築の質問なのですが、、、
3.7kbの親プラスミドのマルチクローニングサイトに、XhoI・NotIで処理した3.1kbのPCR断片を挿入したいと思っています。
当初の実験で失敗（トランスフォーメーション後のコロニー8個中、8つともインサートなし）したため、制限酵素処理からやり直し、ライゲーションのモル比も1：1〜7で振ってやり直しましたが、やはりあたりのコロニーが得られませんでした。
次の策を考えているところなのですが、そもそも、3.7kbの親プラスミドに3.1kbのインサートを入れるのは、大きさ的にやや難しい実験計画と言えるでしょうか？
PCR断片を2つに分け、段階的に入れる、もしくはもっと大きい親プラスミドの方が入れやすい様であれば、親プラスミドの変更も考えたいと思います。
小さい断片のクローニングはある程度の経験があり、2回目の実験では特に慎重に実験をしたつもりですが失敗してしまい、次は何かしらの手を変えたいと思っています。皆様、宜しくお願いいたします。 |
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