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(無題) 削除/引用 No.6773-12 - 2018/04/02 (月) 06:36:47 - タンパク ご意見ありがとうございます。 年度末のためNC購入ができず、PVDFを自分で切ってやっていました。 新年度になり、NC発注しました。 パイロットまではPVDFでうまくいきました。その後のエピトープライブラリースクリーニングはダメでした。数百コロニー（全長の２割でx５、読み枠でx３、遺伝子の向きでx２、安全率x１０＝最低300コロニー）スクリーニングできれば、計算上あたりが取れると考えました。ライブラリー作成後、数コロニーでPCRを行い、インサートが数百塩基あることを確認しました。ライブラリーはそれなりにできているように思います。 今回はエピトープであたりが取れればいいだけです。 無理せず、遺伝子配列をもとに、プライマーを多数組み、２kbの遺伝子を１０のフラグメントにわけ、Westernで調べると言う安全策を入れます。 経験があるという触れ込みで入室した同僚は、似たような方法で３年間、スクリーニングをやりまくり、あたりゼロ。散々資金を使って、トラブル多発。やめました。当たり前ですが、目的タンパクのプローブに依存する印象です。 最終的にはcDNAライブラリーを大腸菌で（タンパク）発現し、タグ付加プローブでのスクリーニングをやりたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6773-11 - 2018/03/24 (土) 11:44:03 - AP コロニーリフトを考えているのなら、成書でそれなりの方法を学んでください。抗体でプロービングする方法も確立されています。 コロニーリフトでPVDFは使わないですね。NCかナイロン。発現ライブラリーを抗体でプローブするならNC。 ファージは高密度スクリーンニングができるところが利点で、 それほど多数のクローンをスクリーニングにかけるのでなければ、コロニーの方がいいかも。

(無題) 削除/引用 No.6773-10 - 2018/03/24 (土) 09:29:30 - AP ドットの真ん中が抜けるのは表面張力のせいかもしれません。 サンプルに少量の界面活性剤を入れておくといいかもしれません。 1 ugは多すぎて剥落する可能性があります。確かキャパシティは平方センチメートルあたり、数百ngだったと記憶します。ドットだと面積はずっと小さいですよね。 酵素抗体法の検出感度はpgオーダーまであります。 NBT/BCIPの発色だと思いますが、ストック溶液に沈殿ができやすいので、顆粒状のノイズが出やすいです。希釈してからフィルターをかけるといいです。バッファーにMgを入れるのが一般的ですが、Mgが析出してこれも顆粒状のノイズになるので、Mgは抜いてしまってかまいません。APにもともと配位しているMgで十分です。

(無題) 削除/引用 No.6773-9 - 2018/03/24 (土) 07:17:26 - タンパク 貴重なご意見ありがとうございます。ニトロセルロースメンブレン購入します。 結論から申しますと、抗GFP抗体を用いたスクリーニングは成功しました。皆様のご意見が力のドライビングフォースです。高バックグラウンドでしたが、パイロット実験としては成功です。拾ったコロニーの７割でGFP発現を確認しました。 次は別タンパクの大腸菌発現エピトープライブラリーに対し、タグ付加した結合タンパクでのスクリーニングです。 最終的には大腸菌発現ライブラリーでタグ付加した結合タンパクでのスクリーニングを目指しています。 最近、Addgene にpET28a MISTIC という大腸菌細胞膜への発現ベクター見つけました。細胞膜表面にタンパクを発現できれば、溶菌しなくても、結合実験ができるのではと期待しています。（おそらく長い遺伝子は難しいでしょうが）ご経験がある方、ぜひ、ご教示願います。

(無題) 削除/引用 No.6773-8 - 2018/03/24 (土) 06:20:00 - qうぇdrf PVDFでやるならドットブロッターかスロットブロッターで強制的に吸引しないと難しい。でもブロッターは見かけによらず安くないので、今だけの実験で買うのはあれなので、あきらめてニトロセルロース膜でやった。ブロッターいらないし、前処理不要でたらせばすぐにしみ込む。データもきれい。

(無題) 削除/引用 No.6773-7 - 2018/03/18 (日) 10:04:07 - おお メンブレンにドロップするとどうしても真ん中が薄くなるという経験は私もあります。

(無題) 削除/引用 No.6773-6 - 2018/03/18 (日) 07:01:17 - タンパク 貴重なご意見、ありがとうございます。一晩たち、少し落ち着きました。 大腸菌培養用のLBプレート上に、（破れにくい）ナイロンメンブレンを置き、大腸菌をまきました。一晩培養後、大腸菌コロニー（数百〜１０００）をレプリカプレート（今回はPVDF）に写し取りました。（ここが現段階） コロニーは大小色々あり、大きなものは数mm以上です。スクリーニング方法の確立を目指している段階です。 平滑末端のEGFP遺伝子フラグメントを大腸菌発現ベクターへいれ、半分程度のコロニーで蛍光を確認しました。蛍光がないコロニーは逆向きにインサートが入ったと思っています。現在は仮想エピトープライブラリーです。これからGFP抗体で反応、２次抗体で発色する予定です。 タンパクの許容量はPVDFが良いと書いてあるので、今回はPVDFを使って見ました。 パイロットのドットブロットでは数mlの増やした大腸菌をリゾチームで溶菌させ、ブロットし、ダメでした。（IPTG誘導で蛍光は確認しています。） フィルター上コロニーの一次抗体反応の前に、溶菌目的にリゾチームで処理した方が、抗体反応には良いと思いますが、どうでしょうか？あるいはDNAスクリーニングのように、SDS（洗剤）を含むバッファーで洗い、コロニーをある程度壊し（タンパクを露出させ）、余計なタンパク（多いであろうコロニー上のタンパク）を除き、メンブレンについているタンパクと一次抗体を反応させる方が良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6773-5 - 2018/03/17 (土) 09:39:10 - mon > 色素物が膜の中にあるのか、表面に付着しているのか、 両方です。粒子の大きさにります。おそらく疎水性相互作用で付着しています。 そのためか（結合容量を超えた）タンパク表面には付着しづらいと想像しています。 ＞格子状になっているはず PVDF膜は格子状では有りません。ボコボコ穴があいている(連なっている）イメージです。メーカーのカタログに電顕像が出ています。 >ドット状に色素が出るかどうかも観察していましたが、 無血清培地を用いた培養上清をスポットした私の経験ではドット状にでました。 10%血清入り培地だと再現性が悪かった(希釈すれば成功した）ことを考慮するとタンパク総量(含量）の違いだと思います。 > コロニーにおける総タンパク量をコントロールするのは、難しいと思います。 「コントロール」とはどの段階の話でしょうか？ どのような操作法か不明ですが、膜上でコロニー形成＞溶菌させたのでしょうか。 それとも膜にコロニーを写し取ったのでしょうか？ 基本的に直径1mm以上だとタンパク過多(溶菌の不十分になる）だと思います。 培地成分がタンパクのブロットを邪魔するかもしれないので最小合成培地が良いかもしれません。あるいはニトロセルロース膜の方が好適かも。 もっともファージ溶菌で成功しているならplasmid(コロニー）に拘らなくてもよいかと思います。ラムダファージならキットもあるし形質転換効率も高いし。

(無題) 削除/引用 No.6773-4 - 2018/03/17 (土) 09:33:19 - MP ニトロセルロース膜ではダメでしょうか？メタノール処理も必要ないしdot blotではこちらの方がしっかりくっつくような印象が（比較したことはありませんが）。

(無題) 削除/引用 No.6773-3 - 2018/03/17 (土) 07:33:53 - タンパク ありがとうございます。参考になります。パイロット実験がこの状況では、先は難しいと感じています。 ＞＞＞＞＞ 不溶性色素が形成・沈殿するだけです。 ・・・それは存じ上げているのですが、色素物が膜の中にあるのか、表面に付着しているのか、あるいはその他の状態なのかが、わかりません。格子状になっているはずの膜の目の部分か、膜の内側に一部入るのだと、思ってます（普通、Western発色後、多少こすっても、バンドは消えないし、濃いバンドの時は裏からもわかるので）。膜の総タンパク量がどの程度色素物の沈殿に影響するのか、検討する必要があるかもしれません。 以前、Western発色時、メンブレンを揺すったら、バンドが剥がれた（なくなった）ことを経験しています。局所のタンパク量が多すぎると、そういうこともあるのかもしれません。今回は、ドット状に色素が出るかどうかも観察していましたが、先に書いた程度（少し、青色の沈殿物がある程度）でした。 量が過多にならないよう、Westernに流すサンプル量の１０％程度でドットブロットしたのですが、他のタンパクもあるわけで、総量としては過多になるのかもしれません。希釈濃度を変えて、条件検討して見ます。 コロニーにおける総タンパク量をコントロールするのは、難しいと思います（すでに同僚もスクリーニングに失敗）。 （面倒ですが）ファージで溶菌させるほうが、安定しているかもしれません。（スクリーニングできなければ、意味がないので。） PCRで５００塩基程度のフラグメントを5'から3'まで（計3kb）多数作製し、発現実験。Westernでタンパク結合部位を同定する一般的方法を採用することも考えています。

(無題) 削除/引用 No.6773-2 - 2018/03/17 (土) 03:23:08 - mon > しかし、どちらも、ドットの中央は白いままです。 > タンパク量が多すぎたのでしょうか？ そうです。FAQです。 > そういえば、どうしてAP発色では膜に色が付くのでしょうか？ FAQです。AP染色のマニュアルを読んでください。 不溶性色素が形成・沈殿するだけです。 > 今後、大腸菌でタンパク発現ライブラリーを目指しております。 出来ます。FAQです。 マニュアル（の引用文献）や各種マニュアル本に記載が有ります。

PVDFのdot blot 削除/引用 No.6773-1 - 2018/03/16 (金) 20:32:35 - タンパク タンパク初心者です。 PVDFメンブレンでタンパクのdot blotをやろうと思います。 とりあえず、メタノールにつけたメンブレンを水になじませ、EGFPを１ug程度スポットし、乾燥させました。 後日、メンブレンをメタノールにつけ、その後、水になじませ、GFP抗体で免疫反応し、２次抗体（AP負荷）で免疫反応、最後に発色しました。 EGFPドットには変な紫色のクズが少しついてました。ネガコンにはなし。 しかし、どちらも、ドットの中央は白いままです。 タンパク量が多すぎたのでしょうか？ そういえば、どうしてAP発色では膜に色が付くのでしょうか？抗体の端にAPがついているだけだと思うのですが、、、 今後、大腸菌でタンパク発現ライブラリーを目指しております。 （無理でしょうか？）以前、ファージで溶菌させたものはうまくいきましたが、より簡便にコロニーでのスクリーニングを目指しています。

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