全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6754-18 - 2018/03/17 (土) 03:51:20 - mon multi-well dishで抗体染色する場合の溶液廃棄は、吸引ではなくdishをペーパータオル（または吸収パッド：介護用が安価）等に裏返して10−20秒程度そのまま放置していました。この方法では上部壁面にも抗体液が触れるので洗浄液はwellにあふれるくらい入れていました。

(無題) 削除/引用 No.6754-16 - 2018/03/16 (金) 21:38:31 - pfa mon様＞ PBS+は使用したことがありません。 一度試してみたいと思います。 tss様＞ 私もピペットマンで吸引しているのですが、いつもはwash操作等に気を遣っておらず勢いよく流していたのかもしれません。抗体反応等ではwell内の溶液を半量交換で実施などコツはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6754-15 - 2018/03/16 (金) 10:42:17 - tss 私も96 wellでの初代神経細胞培養とICCの経験があります。 私の経験ではもちろん固定条件もキーポイントですが、それ以外では試薬の吸引により細胞が剥がれるので注意が必要かと思います。 アスピレーターなどでの吸引では神経細胞が剥がれます。私の所属していたラボでは必ずピペットで培地やICC試薬を除去るようにしていました。

(無題) 削除/引用 No.6754-14 - 2018/03/14 (水) 18:14:23 - mon Ca+,Mg+がないと剥がれやすいのかもしれませんね。 神経細胞ではなくHEK293細胞ですが、PBS(+)+0.1%BSAで洗浄、PBS(+)+0.01%BSAで抗体処理を行っていました。 理由は不明ですがPBS(+)単独より剥がれる細胞が激減しました。溶液は壁面から優しく注いでもいました。PBS(-)ではPFA固定したHEK293細胞がほとんど剥がれて無残でした。 PBS(+)はCaPO4沈殿が出来るので用事調製していましたが、HBSS(+)やTBS(+Ca,+Mg)でも良いかも。

(無題) 削除/引用 No.6754-13 - 2018/03/13 (火) 13:51:13 - pfa み様＞ 培養は共培養で行っており、標識した神経細胞を観察しています。 live観察では元気そうなのですが、PFA固定操作や、その後のwash、免疫染色の操作で剥がれている気もします。 染色操作等で皆様が工夫されていることがあれば、お教えいただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.6754-12 - 2018/03/13 (火) 09:36:14 - み 96 well plate表面のcoatingは何で処理されていますか？ 何週間培養ですか？ 長期間培養し過ぎたり、coatingが不適切だとシート状に細胞が剥がれてくる場合があります。 あるいは既に死んでいる（弱っていた）細胞は液交換ではがれやすい。 >[Re:11] pfaさんは書きました : > 皆様＞ > > ご回答ありがとうございます。 > > 固定方法をPBS wash後に4℃の4%PFAを加えたところ、やはりいくつかの細胞が剥がれてしまったようです。細胞体の部分が抜け落ちていて、その周囲に神経突起が残っている感じです。

(無題) 削除/引用 No.6754-11 - 2018/03/13 (火) 08:54:21 - pfa 皆様＞ ご回答ありがとうございます。 固定方法をPBS wash後に4℃の4%PFAを加えたところ、やはりいくつかの細胞が剥がれてしまったようです。細胞体の部分が抜け落ちていて、その周囲に神経突起が残っている感じです。 通りすがりさんのコメントを参考に、次回は温めたものでトライしてみます。この他にも神経細胞が剥がれにくい固定方法等ご存知であればご教示していただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.6754-10 - 2018/03/11 (日) 19:52:44 - toto えっと、「注：60Cくらいまで温度を上げて溶かすことは昔からしばしば行われていますが、蟻酸の生成を促す恐れがあるらしいので勧めません。)」というのは要訂正。粉末のPFAはホルマリンが共有結合してポリマーになっているもので、60度に加熱して水酸基を加えることでモノマーへの分解が早まります。水でも少しアルカリにすると加水分解されてモノマーになりますが、何日もかかります。また溶けてはいても、モノマーだけでなくて様々な重合体が残ります。ホルマリン溶液として売られてるものに含まれるメタノールは、この逆反応を抑えるためのものです。 http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm に詳しく解説してあります。

(無題) 削除/引用 No.6754-9 - 2018/03/11 (日) 13:27:08 - 通りすがり 初代神経細胞で経験があります。 株細胞と異なり、重要な点は、固定されるまで温度を37度に保つことです。 インキュベーターから取り出し、必要であれば37度に温めておいたPBSでwash、 37度に温めておいた2%PFA/PBSで10分@37度の恒温槽で固定（密閉してください）、4%PFA/PBSで10分@室温固定、PBSに置換、以降、通常のイムノサイト です。 固定時間は適宜、optimizeしてください。 PFAは粉末から用事調整していました。 ホットスターラーで、1N NaOHを1-2滴加えたDWを60度くらいに温めて、秤量したPFAを加える（遮光） 数分後、ホットスターラーから下し（完全に溶けていなくても、ほぼ溶けていれば大丈夫です）、10XPBSを加えて冷却 冷めきったらフィルターろ過 こんな感じです。

(無題) 削除/引用 No.6754-8 - 2018/03/10 (土) 17:15:14 - えあqzsxでcfrvgtbh メーカーによっていろいろとおもいますが、市販の4%PFA/PBS溶液には安定化のためにメタノールを含む場合がしばしばあります。ラベルのどこかに小さく書いてあるかもしれません。同一メーカーでもメタノールありなしで何種類かバリエーションがあることもあります（メーカーサイトで確認下さい）。それ以外の安定化剤を添加することもあるかもしれませんが、わたしは詳しくないです。 市販のPFA溶液もいろいろなものがあります。使用している市販PFAがどういう組成のものか一度確認ください。 メタノールの影響、とくに培養細胞の免疫染色で細胞の外側だけ染める目的がある場合に細胞膜の透過性に影響を与えることが気になるときは、自作のものを使うほうが安心ということもあり、昔から培養細胞の免疫染色では自作品を使用する人が多いようにおもいます。上記のことが直接関係なくても、もし固定のステップが気になるようであれば、面倒でも自作して調製後は早めに使用するようにしたほうが確実とおもいます。PBSへのPFAの上手な溶かし方やpHの調整は初心者むけの実験書やネットなどで情報収集出来ると思うのでチェックしてください。(注：60Cくらいまで温度を上げて溶かすことは昔からしばしば行われていますが、蟻酸の生成を促す恐れがあるらしいので勧めません。) 固定時間は結果を左右するかなり重要な要因になるようなので必要に応じて検討ください。組織の場合は組織塊の内部までPFAが浸透するのに時間がかかるので数時間とかO/Nで行いますが、培養細胞はそうした必要がないので、通常は数分ないし十数分の短時間で行います。）

(無題) 削除/引用 No.6754-7 - 2018/03/10 (土) 07:37:06 - pfa えあqzsxでcfrvgtbh様＞ ご指摘ありがとうございます。 仰る通り、4%PFAの半量交換では終濃度が2%ですね。また培地中にも終濃度1%でFBSを添加しておりました。これらの点が悪影響していたのかもしれません。 培養プレートには予めコーティングを施しており、培養中はプレートをゆすったりする程度では神経突起も含めびくともしないぐらいしっかりと貼りついています。 PFAについてですが、うちのラボには4%試薬特級（4℃保存）とPFA（粉末）の二種類があります。培養細胞の固定では粉末から用事調整を心掛けた方が無難でしょうか？それとも4℃保存の液体タイプでも固定能力に大差ないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6754-6 - 2018/03/10 (土) 00:25:36 - えあqzsxでcfrvgtbh 質問にあるようなPFAの培地への半量添加は私は見聞きしたことはありませんが、この方法にはいくつか気になる点があります。この場合、実際の固定は2%PFAですので、固定の効果は一般的な４％PFAの時よりも弱くなるでしょうし、固定されるまで時間もかかるように思います。PFA固定の反応機序を復習してもらうとわかるとおもいますが、もし血清添加培地にPFAを半量入れてたならば培地中に存在するアミノ酸や血清蛋白質などPFAの反応する相手は細胞の蛋白質よりもはるかに多いわけですから、加えたPFAは前者に消費され、もともと濃度が半分ですし細胞蛋白質の固定にはさらに不十分になるような感じがします。結果として、細胞自体はPFAの毒性で死滅する(蛋白質のアミノ酸側鎖を修飾しますから、仮に固定が十分でなくても、細胞膜やいくつか重要な分子が影響受ければ死にます）が、固定は不完全ゆえ、その後の形態の維持ができない（で洗浄過程で剥がれ落ちる）ということのような気がします。 細胞と培養基質（プレートとかディッシュ)とへの接着性は細胞の種類によりしばしば異なることがあり、必要に応じて特定のものを使用するとか、基質に前処理とかを要するものもあったと思います。接着が弱いと洗浄や固定操作等の過程で剥がれやすいです。その辺はどうでしょうか。 PFAによる固定の時間はその後の抗体反応の成否に大きな影響を与える場合があります。培養細胞の場合は、通常は室温2~10分くらいの範囲とおもいますが、長すぎるのは良くないです。

(無題) 削除/引用 No.6754-5 - 2018/03/09 (金) 21:03:00 - pfa AP様＞ ご回答ありがとうございます。 なるべく素早い固定にトライしてみたいと思います。 うちでは4%PFAを室温反応が一般的なのですが、培養細胞ではそれ以外の濃度や反応条件が良いなどご存知ないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6754-4 - 2018/03/09 (金) 20:41:10 - AP 培養細胞であれば、段階的置換や冷却はあまり意味がないような。 浸透に時間がかかる組織、浸透圧や固定に非常に敏感な構造なんかは別として。 培地に固定液を入れるとアミノ酸などの培地成分と副反応を起こしそうだし。 何にせよ、素早く固定が完了する方法がいいと思う。もしそれで剥がれるようなら、ディッシュの種類やコーティングを検討したほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.6754-3 - 2018/03/09 (金) 19:05:35 - pfa み様＞ ご回答ありがとうございます。 細胞はlive imagingで撮影しており、最終撮影の直後に固定および免染をしています。しかし、その後の観察で目的の細胞が消失していることがあり、固定方法の見直しを検討しています。 PFA半量交換のように穏やかな操作が、固定化の前に細胞死および剥離を促しているのかと疑問に思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.6754-2 - 2018/03/09 (金) 19:03:32 - み 固定の前に死んでいたら培養自体が上手くいっていないのでしょう。 固定後に死んだということなら当たり前でしょう。 >[Re:1] pfaさんは書きました : > 現在、神経細胞の培養をしているのですが、4%PFA固定の前後で細胞の一部が死んでしまっている印象です。

PFA固定 削除/引用 No.6754-1 - 2018/03/09 (金) 17:50:36 - pfa 培養細胞のPFA固定について 現在、神経細胞の培養をしているのですが、4%PFA固定の前後で細胞の一部が死んでしまっている印象です。具体的な操作としては、96wellプレートで培養している神経細胞（培地200ul）を4%PFAで半量交換で室温15分間放置、その後、全量交換で室温15分放置しています。 このように徐々にPFAに置換する操作はよくないのでしょうか？または、冷蔵した4%PFAを全量交換で一気に固定した方がしっかり固定できるのでしょうか。 皆さまの固定方法についてご意見いただけると幸いです。

全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---