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(無題) 削除/引用 No.6747-8 - 2018/03/07 (水) 06:11:52 - おお >[Re:7] あwせdrftgyふさんは書きました : > 無血清培地にして培養液中に分泌された蛋白質を分析することは昔からよく行われますが、この場合、培養上清の蛋白質濃度は通常非常に低いのでそのままだとwestern等でも検出が難しい場合がしばしばあります。 後学のために教えてください。実際ご自身の経験では培地中にトータルのタンパク量としてどれくらいの量あると（ご自身の系では）見積もられますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6747-7 - 2018/03/06 (火) 21:51:08 - あwせdrftgyふ 無血清培地にして培養液中に分泌された蛋白質を分析することは昔からよく行われますが、この場合、培養上清の蛋白質濃度は通常非常に低いのでそのままだとwestern等でも検出が難しい場合がしばしばあります。なので濃縮した方がいいと思います。蛋白質にダメージが少なくて確実な方法としては80%飽和硫安で4Cで一晩くらいかけて沈殿させてから遠心して、沈殿を少量の適当なbufferに可溶化し、同じbufferに透析すればいいかんじの蛋白質試料になります。protein assayを妨害するような低分子物質は透析の際に除かれます、

(無題) 削除/引用 No.6747-6 - 2018/03/06 (火) 14:15:41 - おお https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/TR0068-Protein-assay-compatibility.pdf Pierce 660nm Protein Assay Reagent 23236 Coomassie Plus (Bradford) 23200 Coomassie (Bradford) 上記はある程度フェノールレッドが入っていても使えるらしい。 発想をかえて、フェノールレッドフリーの同様な培地があればそちらを使う。

(無題) 削除/引用 No.6747-5 - 2018/03/06 (火) 13:52:20 - ~ 培養上清中タンパク質の糖鎖解析はいろいろと報告があるので、それを参考にしては。 限外濾過フィルターでバッファーチェンジするプロトコルが多いと思います。 バッファーチェンジしないなら、あなたの使う無血清培地中の成分があなたのやろうとする酵素反応に影響しないことを確認しないといけないでしょう。 その組み合わせが文献で報告済みなら、タンパク質量の測定方法も書かれているのでは。

(無題) 削除/引用 No.6747-4 - 2018/03/06 (火) 11:09:17 - xyz 培地にもよると思いますがBCAアッセイでのworking reagentは50倍とか100倍希釈しますよね。 それならば培地の吸光度は大きく影響しないのではないでしょうか。 心配であれば、下記サイトのようにBSAなどを添加して定量性を確認してみてはどうでしょう。 培地の希釈倍率が低くても定量性はあるかもしれません。 https://www.promega.jp/resources/pubhub/enotes/compatibility-of-pierce-bca-protein-assay-with-promega-lysis-buffers-and-lytic-reagents/

(無題) 削除/引用 No.6747-3 - 2018/03/06 (火) 11:02:23 - 初心者 >>培養上清のまま酵素消化するおつもりですか？ そうです

(無題) 削除/引用 No.6747-2 - 2018/03/06 (火) 10:54:26 - qq 培養上清のまま酵素消化するおつもりですか？

細胞培養上清の総タンパク量 削除/引用 No.6747-1 - 2018/03/06 (火) 10:49:27 - 初心者 いつも勉強させていただいております。 無血清の細胞培養上清に分泌したある特定のタンパク質の糖鎖を切断するために酵素処理したいのですが、タンパク質○μgに対して△U添加するというプロトコルのため、添加する酵素のユニット数を決めるために培養上清の総タンパク質量を測定したいです。 細胞培養培地には色がついているため、吸光度法やBCA法では総タンパク質量を定量することは難しいのでしょうか？ なにかいい方法をご存知の方がいらっしゃれば教えていただきたいです。 ご意見よろしくお願いいたします。

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