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(無題) 削除/引用 No.6743-8 - 2018/03/08 (木) 07:29:39 - 顕微鏡 コンフォーカルのほうがイメージなさっている蜂の巣的な網状的な画像を得やすいでしょうね。ご近所にあるといいのですが。あとwashも短くないでしょうか？抗体が残ってしまっているとか。当方ブロッキングはいつも2-5%BSAで行っています。カドヘリンではなく別のものですが、特に支障が出たことはないです。私でしたらPFAで固定後にTritonX-100したものとメタノールしたもの、ブロックもして、１次抗体O/N後に洗いをもう少し長くしたものを観察して実験条件を試してみますかね。『A549 E-cadherin』で画像検索しますと、細胞のふちにきれいに染まりつつも、内部も少し染まっているように見える写真もありますね。

(無題) 削除/引用 No.6743-7 - 2018/03/07 (水) 23:05:59 - おお 細胞内にもあるのでは？細胞内と言っても小胞などの膜フラクションですけど。 またコンフォーカルじゃなければ、細胞上部、下部の細胞膜のシグナルも拾うので、細胞内にあるように見える可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.6743-6 - 2018/03/07 (水) 19:33:53 - カドヘリン みなさまお返事いただきありがとうございます。 観察はコンフォーカルではなく、通常の蛍光顕微鏡を使っています。 抗体はPurified Mouse Anti-E-Cadherin Clone 36/E-Cadherin Catalog No. 610182を使っています。 データシートには50倍と書いているのですが２０００倍でも染まるんですね。貴重な情報ありがとうございます。 室温で１時間反応させた方が染まりがいいのでしょうか？ ウエスタンにしろ染色にしろ短時間より４度でオーバーナイトの方がどの抗体でもうまく行くイメージですが。もちろん抗体と細胞の組み合わせによるとは思いますが。。。 細胞のコンフルエンシーについてですが、８ウェルチャンバースライドにぎっしり隙間ないくらい細胞がいるわけではありませんが８割くらいのコンフルエンシーです。 前日に細胞を撒いて、翌日（約２４時間後）細胞を固定しているのですが、もう少しスライドチャンバー内で培養した方が細胞のEカドヘリンが綺麗に見えるとかあるのかな、とふと思ったりしました。 細胞内にシグナルがなく、細胞膜だけが染まるような画像が欲しいのですが、細胞内も割と染まっている印象です。Blockingはしていないので次回やってみようかと思います。１次抗体をかける際に5%FBS/PBSを使用しています。本当は２次抗体の種に対する血清を使用すべきかと思いますが、皆様はどのようなBlocking bufferを使用していますでしょうか？ナカライのブロッキングワンか、Cell signaling（Normal Goat Serum #5425）もしくはInvitrogen（Blocker™ BSA (10X) in PBS Cat. 37525）で売っているBlocking試薬を使ってみようと思いますがオススメがありましたら教えてください。 BDの抗体を使用した時のプロトコールをお教えいただくことは可能でしょうか？ 固定はPFAのみですか？PFA固定後メタノールでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.6743-5 - 2018/03/06 (火) 06:13:31 - X 固定前の細胞の状態はコンフルエントのモノレイヤーになっていますか？　それとも低密度でシングルセル、あるいは細胞のクラスターが点在するような感じでしょうか？　細胞膜で安定化したEカドヘリンをA549で見る場合は、コンフルエントに近い状態でタイトな細胞間接着が維持されている方が良いように思います。 BDのEカドヘリン抗体との事ですが、我々のラボで使っているBD Transuction Laboratoriesの抗体と同じ（C末の細胞内ドメインと結合するマウスモノクロ）であれば、かなり染まりが良いので、1:100だと濃すぎるかもしれません。我々のラボでは1:2000、室温１時間で十分染まる感じです。濃すぎると非特異結合によるバックグラウンドで細胞質が染まっているように見えるかもしれません。 あと、ブロッキングはどうしてますか？　バックグラウンドで細胞質が染まっているように見えるのであれば、ブロッキングを工夫しても良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6743-4 - 2018/03/06 (火) 04:38:39 - 顕微鏡 記事ID ： 15506 Proteintech社　免疫蛍光染色（IF）のヒントとコツ https://www.cosmobio.co.jp/support/technology/a/immunofluorescence-tips-pgi.asp コスモバイオ社のサポート情報ではPFAで固定後にメタノールで透過処理してきれいに染まっていますね。

(無題) 削除/引用 No.6743-3 - 2018/03/06 (火) 02:55:40 - おお コンフォーカルか普通の蛍光顕微鏡かでも見え方も違うと思うけど、どっち？

(無題) 削除/引用 No.6743-2 - 2018/03/06 (火) 02:18:11 - 顕微鏡 観察時のフォーカスする位置が細胞に対して高かったり低かったりすると細胞表面のカドヘリンがあたかも細胞の中、細胞質に染まって見えてたりしませんでしょうか。うまいこと細胞の真ん中を切るようなところでピントを合わせるとどうでしょう。

E-カドヘリン染色の条件検討について 削除/引用 No.6743-1 - 2018/03/06 (火) 02:05:41 - カドヘリン A549細胞を使ってE-cadherinの染色を行なっているのですが、細胞膜に沿って染まるような実験結果が得られず困っています。染まって入るものの、細胞室が染まっている感じです。 実験のプロトコールは以下になります。 4%PFA 30分 室温で固定 PBS wash 3分 x 3 0.5% TritonX-100 10分 室温 E-カドヘリン抗体（100倍希釈、BD）オーバーナイト 4℃ PBS wash 3分 x 3 ファロイジン（400倍、sigma）+ 2次抗体Alexa-488（300倍、Invitrogen） PBS wash 3分 x 3 マウンティング（DAPI含有） 観察 条件検討が必要だとしたら、固定条件なのでしょうか？ 抗体は結構濃いと思うのですが。 ご経験のある方よろしくお願いします。

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