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(無題) 削除/引用 No.6743-23 - 2025/11/28 (金) 04:56:26 - おお FYI PMID: 12597622 DOI: 10.4081/1749 …. PLP fixation of isolated epidermal sheets, consistently provided for good preservation of morphology and intense labeling of major histocompatibility complex class II molecules, CD 1 a, CD4, CD8, E-cadherin, cytokeratins in genera…..

(無題) 削除/引用 No.6743-22 - 2025/11/26 (水) 13:23:02 - はつ ちなみに、ディッシュのコーティングの種類や有無でE-cadherinの発現が変わったりするのだろうか？ 剥がれやす細胞だとポリリジンコートとかする場合も有ると思うけど。

(無題) 削除/引用 No.6743-21 - 2025/11/26 (水) 12:54:54 - 711 議論になっているE-cadherinの蛍光抗体法による免疫染色について、いろいろな細胞を使い、MeOH固定とPFA固定で比較検討しているこの論文はたぶん一定の答えになると思うので一度読んでほしい。方法だけでなく使用した抗体の情報も出てるのでその点でも有用と思う。 ttps://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8777374/

(無題) 削除/引用 No.6743-20 - 2025/11/26 (水) 00:16:35 - E >[Re:19] ちょっとGPTさんは書きました : > コールドメタノール固定は本当に良いのか？（重要） > ▶ E-cadherin では “基本的に不適” > 理由： なるほど。私の場合ですと昔固定条件をいくつか試したところPFAとMethanolでだいぶ染まり方が違う思いましたので固定条件を変えたらどうかなとおもいました。思い出すと特に核膜がmethanolできれいに染まっていたかな。だいぶ前なのではっきりとは覚えておりませんが。おっしゃるように細胞膜には向かないかもしれませんね。まぁいろいろ試してみて、フィードバックしていただけると参考になります。

(無題) 削除/引用 No.6743-19 - 2025/11/25 (火) 18:25:47 - ちょっとGPT 文字化け部分は： 　–　　は、から コールドメタノール固定は本当に良いのか？（重要） ▶ E-cadherin では “基本的に不適” 理由：メタノールは 脱水・沈殿固定 　→ 細胞膜の脂質構造を破壊し、接着構造も壊れやすい Epitope が露出しすぎて non-specific binding 増大 細胞が縮む・形態が崩れることがある ▶ メタノール固定が向くのは下記の場合のみ 内在化中の受容体 12回膜貫通の GPCR のような「脂溶性・可動性の高い膜タンパク」 一部のリン酸化抗原（フォスファターゼ抑制を兼ねるため） ➡ E-cadherin（接着複合体）は PFA 固定の方が再現性が高い。 海外プロトコルでも 95%以上は PFA固定 + mild permeabilization。 膜タンパク質（12回スパン）＝全く別物。 E-cadherinとは結合状態・局在・安定性が異なる。 同列で語れない。

(無題) 削除/引用 No.6743-18 - 2025/11/25 (火) 18:21:49 - ちょっとGPT E-cadherin が細胞膜に見えず、全体がぼんやり染まる原因は、 �@コンフルエンシー（低密度） �A固定条件（PFA強すぎ・時間長すぎ） �B透過処理（Tritonの過剰） の３つが圧倒的に多いです。 特に E-cadherin は “細胞同士がしっかり接している時だけ” 強く膜に並ぶため、 ・コンフルエンシー80–100% で固定することが最重要です。 推奨条件： 4% PFA 10–15 min（30 min は長すぎて diffuse になりやすい） Triton は使わないか、0.05–0.1% に弱める（0.5% は膜タンパクでは強すぎ） ブロッキングはタンパク質系を避け、PEG/PVP など非タンパクが安全 一次抗体 610182 は 1:200–1:500 が最適なことが多い（濃すぎても背景↑） ◆ まとめ（本当に重要なポイントだけ） コンフルエンシー：80–100% 必須 　→ 低密度だと膜に並ばず、細胞質の diffuse になる。 固定：PFA 10–15 min 　→ 30 min固定は過剰架橋で抗原が広がって見える典型パターン。 透過処理：弱める or なし 　→ Triton 0.5% は E-cadherin を溶出させ diffuse に見える原因。 抗体濃度：1:200–500 　→ 濃すぎると非特異的に細胞全体が淡く染まる。

(無題) 削除/引用 No.6743-17 - 2025/11/24 (月) 15:37:47 - スライド 711様 ありがとうございます。 まずは仰る通りでやってみます！

(無題) 削除/引用 No.6743-16 - 2025/11/23 (日) 03:12:12 - 711 メタノール固定時は-20℃に入れてます。ー20℃のメタノール使用してもRTでやればまもなくメタノールもRTになるので低温メタノールを使う意味がありません。有機溶媒での固定は低温の方がより効果が高いと昔、学生の時習いました。その理由も物理化学的な点から説明受けましたが詳細忘れました。あと低温の方が細胞の収縮が起きにくく形態がいい感じで保持できてるように感じます。メタノール以外に低温アセトンや低温エタノールを使う人もいます。原理的には同じですので大差ないかもしれないですが、アセトンはある程度細胞や組織の収縮が起こるかもしれません。あとチャンバースライド機材やパッキンの材質によってはアセトンに耐性がないことがあるのでもしアセトンを使う場合は事前にチェックを。 固定液を入れる際は細胞に直接吹き付けないようにチャンバーなりdishの壁から伝わらせるように丁寧に静かに入れましょう。雑に入れると細胞が剥がれることがあります（特に細胞が多い時）。

(無題) 削除/引用 No.6743-15 - 2025/11/22 (土) 23:27:18 - スライド 皆様、貴重なご意見ありがとうございます！ 研究室にあるので、まずは-20℃メタノール固定を検討してみます。 また、フォーカスですが、ピントは接着部位に合わせています。 それでもなんかぼんやり、といった感じです。 なお、メタノール固定中は冷凍庫に入れるほうが条件的には良いのでしょうか？ 固定中は冷蔵庫（4℃）に入れる方もいらっしゃるようですが。 それとも-20℃のメタノールさえ使えば、反応中はRTでも変わらないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6743-14 - 2025/11/22 (土) 04:31:20 - おお 膜タンパクの固定ならPLP固定という方法があります。糖鎖なども固定されるために膜上での蛋白保持に有利なのだと思います。 抗体が細胞外ドメインを認識するようであれば膜透過は必要ないと思いますがどうでしょう（BDは二種類見つけることができたのですが、両方ともC末で細胞内かな）。また、細胞内の蛋白でも膜透過処理無しでちゃんと染まるものもあります。 細胞外ドメインを認識する抗体があるなら、生細胞を固定せずに抗体と反応させて、その後固定して観察という手もあります（この場合エンドソームやゴルジなどでプロセス中のものなどは見れません）。それでも同じように見えるなら、細胞表面にあるけどコンフォーカルのように切断面で捉えてないのでそう見えるだけとも言えます。 細胞表面にあるということは通常の蛍光顕微鏡でみれば、エッジ（輪郭）だけでなく細胞の観察している中心部も膜に覆われているわけです。ぼやっと見えるのはフォーカスが合わない細胞表面全体のシグナルが見えるだけなのだと思います。リンク先のイメージを見ましたか？ コンフォーカルを使わず通常の顕微鏡でできる可能性があるなら、なるべく細胞のエッジにフォーカスが合うようにすればましになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6743-13 - 2025/11/22 (土) 01:20:47 - E >[Re:12] ７１１さんは書きました : > 固定をPFAでなくて、あらかじめ冷却したメタノールで-20℃で10分間、固定してみてください。 私も固定条件を変えるといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6743-12 - 2025/11/21 (金) 20:44:29 - ７１１ 固定をPFAでなくて、あらかじめ冷却したメタノールで-20℃で10分間、固定してみてください。 別の膜タンパク質（12回？スパンニングしてるガチの膜タンパク質）での経験ですが、PFA固定だと細胞膜がほとんど何も染まらなくて細胞質が染まったので、冷メタノール固定に変えたところ細胞膜が綺麗に染まりました。細胞質も薄く染まりましたが　細胞膜＞＞＞細胞質でした。　固定法が違うとこんなに違うものかと思い、それからは初めて使う抗体については、異なる固定法で比較検討してます。 固定中に抗原が動くというのを聞いたことがあります。PFAだとそういう可能性もあるのかもしれません。 抗体反応はO/Nと室温では染まる場所は変わらなあいけれどシグナル強度の点では異なることがあります。ただどちらが強いかは抗体により異なります。時間については室温ならば1時間以上であれば多くの場合、十分と思います。 仮に１時間を２〜３時間にしてもあまり変わらない感じがしています。 透過処理はTriton X100は０.２％で10minでやってます。メタノール固定では必須ではありませんが、一応してます。0.5%は少し高い気がしてます。固定が不完全のまま透過処理するとタンパク質の中には漏出してしまうおそれるもあるような気がします。 共焦点と普通の広視野の見え方の違いもあるかもしれないですが、膜タンパク質はどちらの顕微鏡で見ても膜に沿って染まるパタンが見えます。 抗体名で画像検索するとわかると思いますが、同じ抗原と反応する抗体でもメーカーとかクローンによって染まる場所が全然違うことがあります。論文でも本文では膜蛋白質ということで話が進んでいるにも関わらず、Figは細胞質が染まってたりします。

(無題) 削除/引用 No.6743-11 - 2025/11/21 (金) 11:30:23 - スライド おお様 情報をいただきありがとうございます。 現時点では以下のような感じです。 ・共焦点ではなく、通常の蛍光顕微鏡 ・細胞はモノレイヤーでコンフルエントになるよう培養。 ・固定は4%PFA ・透過処理は0.05%PBST ・ブロッキングは5%BSA ・抗体濃度はx100からx1000で検討→強度は変わるが、ぼんやり染まるのは変わらない。 透過し過ぎは良くないかと0.05%PBSTで行っていたのですが、逆に弱すぎるのかなとも思っています。 その他は代表的なプロトコルから大きくハズレたことはしていないとは考えています。

(無題) 削除/引用 No.6743-10 - 2025/11/21 (金) 11:08:49 - おお https://www.researchgate.net/figure/mmunofluorescence-assay-of-STAT3-E-cadherin-N-cadherin-and-vimentin-expression-in-A549_fig3_304364601 https://www.researchgate.net/figure/mmunofluorescence-staining-demonstrated-that-UDCA-restores-E-cadherin-expression_fig3_364755085 このスレッドの内容は確認されましたか？そのうえでどうお考えですか？ コンフォーカル（場合によってはデコンボリューションやアプトーム）か通常の顕微鏡かとかでも見え方が違ってくるだろうという話もしています。上記の例は多分コンフォーカルなどではない通常の顕微鏡を使っているものと思われます。論文から確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.6743-9 - 2025/11/21 (金) 09:57:26 - スライド 古いスレッドですが、類似内容なので使用させていただきます。 現在、MCF-7でカドヘリン様と同様にE-cadherinの染色を検討しています。 抗体もPurified Mouse Anti-E-Cadherin (610182)を使用しています。 抗体濃度もx100〜ｘ1000まで検討したのですが、細胞間ではなく全体がぼんやり染色される感じです。 皆様がE-cadherinを染色される際、特に注意されていることなどあればご教授いただきたいです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.6743-8 - 2018/03/08 (木) 07:29:39 - 顕微鏡 コンフォーカルのほうがイメージなさっている蜂の巣的な網状的な画像を得やすいでしょうね。ご近所にあるといいのですが。あとwashも短くないでしょうか？抗体が残ってしまっているとか。当方ブロッキングはいつも2-5%BSAで行っています。カドヘリンではなく別のものですが、特に支障が出たことはないです。私でしたらPFAで固定後にTritonX-100したものとメタノールしたもの、ブロックもして、１次抗体O/N後に洗いをもう少し長くしたものを観察して実験条件を試してみますかね。『A549 E-cadherin』で画像検索しますと、細胞のふちにきれいに染まりつつも、内部も少し染まっているように見える写真もありますね。

(無題) 削除/引用 No.6743-7 - 2018/03/07 (水) 23:05:59 - おお 細胞内にもあるのでは？細胞内と言っても小胞などの膜フラクションですけど。 またコンフォーカルじゃなければ、細胞上部、下部の細胞膜のシグナルも拾うので、細胞内にあるように見える可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.6743-6 - 2018/03/07 (水) 19:33:53 - カドヘリン みなさまお返事いただきありがとうございます。 観察はコンフォーカルではなく、通常の蛍光顕微鏡を使っています。 抗体はPurified Mouse Anti-E-Cadherin Clone 36/E-Cadherin Catalog No. 610182を使っています。 データシートには50倍と書いているのですが２０００倍でも染まるんですね。貴重な情報ありがとうございます。 室温で１時間反応させた方が染まりがいいのでしょうか？ ウエスタンにしろ染色にしろ短時間より４度でオーバーナイトの方がどの抗体でもうまく行くイメージですが。もちろん抗体と細胞の組み合わせによるとは思いますが。。。 細胞のコンフルエンシーについてですが、８ウェルチャンバースライドにぎっしり隙間ないくらい細胞がいるわけではありませんが８割くらいのコンフルエンシーです。 前日に細胞を撒いて、翌日（約２４時間後）細胞を固定しているのですが、もう少しスライドチャンバー内で培養した方が細胞のEカドヘリンが綺麗に見えるとかあるのかな、とふと思ったりしました。 細胞内にシグナルがなく、細胞膜だけが染まるような画像が欲しいのですが、細胞内も割と染まっている印象です。Blockingはしていないので次回やってみようかと思います。１次抗体をかける際に5%FBS/PBSを使用しています。本当は２次抗体の種に対する血清を使用すべきかと思いますが、皆様はどのようなBlocking bufferを使用していますでしょうか？ナカライのブロッキングワンか、Cell signaling（Normal Goat Serum #5425）もしくはInvitrogen（Blocker™ BSA (10X) in PBS Cat. 37525）で売っているBlocking試薬を使ってみようと思いますがオススメがありましたら教えてください。 BDの抗体を使用した時のプロトコールをお教えいただくことは可能でしょうか？ 固定はPFAのみですか？PFA固定後メタノールでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.6743-5 - 2018/03/06 (火) 06:13:31 - X 固定前の細胞の状態はコンフルエントのモノレイヤーになっていますか？　それとも低密度でシングルセル、あるいは細胞のクラスターが点在するような感じでしょうか？　細胞膜で安定化したEカドヘリンをA549で見る場合は、コンフルエントに近い状態でタイトな細胞間接着が維持されている方が良いように思います。 BDのEカドヘリン抗体との事ですが、我々のラボで使っているBD Transuction Laboratoriesの抗体と同じ（C末の細胞内ドメインと結合するマウスモノクロ）であれば、かなり染まりが良いので、1:100だと濃すぎるかもしれません。我々のラボでは1:2000、室温１時間で十分染まる感じです。濃すぎると非特異結合によるバックグラウンドで細胞質が染まっているように見えるかもしれません。 あと、ブロッキングはどうしてますか？　バックグラウンドで細胞質が染まっているように見えるのであれば、ブロッキングを工夫しても良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6743-4 - 2018/03/06 (火) 04:38:39 - 顕微鏡 記事ID ： 15506 Proteintech社　免疫蛍光染色（IF）のヒントとコツ https://www.cosmobio.co.jp/support/technology/a/immunofluorescence-tips-pgi.asp コスモバイオ社のサポート情報ではPFAで固定後にメタノールで透過処理してきれいに染まっていますね。

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