全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6736-8 - 2018/03/08 (木) 14:04:30 - ひよこ おお様、 何度もご回答ありがとうございました。 漠然とした質問を投げかけてしまいましたが、自分の知りたかったイメージをつかむことができました。ひとまずできることがありそうですので、やってみて、また困ったら質問させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.6736-7 - 2018/03/07 (水) 06:19:57 - おお 検出限界以下なので差があると言えると思いますが、一方を検出限界以下としてCt値などを表にすることはできるかもしれません。 棒グラフだと、相対量に換算してワイルドタイプを１とか１００％にしてノックアウトマウスの方は棒を表示せずND（Not detected)と表記するか。

(無題) 削除/引用 No.6736-6 - 2018/03/06 (火) 14:28:05 - ひよこ おお様、 ありがとうございました。 物分かりが悪くて申し訳ありませんが、例えば、あるプライマーを使ったqPCRで、ワイルドタイプでは増幅が良好にみられ、ノックアウトマウスでは増幅が40サイクルでも見られなかったとします。 これは定量性がないということですよね？単純に両者を並べて比較したグラフのようなFigは作ることができないということなのでしょうか？ 抽象的なことを言ってすみません。

(無題) 削除/引用 No.6736-5 - 2018/03/05 (月) 18:18:25 - おお 理論的にはとかいたのはあなたが発現が低いというのがどれくらい低いのか想像ができないからです(別にコピー数が何個と見積もれとは行ってないですけど)。ただ簡単に言うと検量線に乗らないサンプルは定量できないと考えるべきでしょうこの場合は。

(無題) 削除/引用 No.6736-4 - 2018/03/05 (月) 12:06:13 - ひよこ おお様、 ご回答ありがとうございます。 理論的には…というお話は私も度々耳にしましたが、理想的な実験になるとは限らないので、あえて広く一般論をうかがいたいと思い、あいまいな表現になってしまいました。 インプットを増やすのが難しい条件を想定しているのですが、それができれば解決しますね。私の周りでは定量性が保たれる範囲を自分の系で特に考慮していない人ばかりでしたので、質問させていただきました。 PolyAについてのアドバイス、私は思いつきませんでしたので、感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.6736-3 - 2018/03/04 (日) 07:06:31 - おお 経験ではなく頭の理屈だけでかくと、 もし発現量が低くて測れないならば、PolyA精製するといいかもしれない。その時はInternal controlは強く出過ぎるかもしれないので、希釈して図らないと行けないかもしれない。 また、スペシフィックプライマーでRTするならばPCRのとき多分もう少しInputを増やせるんじゃないか？そういうプロトコールを探してみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6736-2 - 2018/03/03 (土) 17:32:45 - おお 細かいことは置いといて理想的な系でチューブに１０コピーもあれば検出できます。それ以降はだんだんブレが大きくなってきて正確な測定がしにくくなるでしょう。理想的な状態であればサイクル数は３５サイクルぐらいででなければないと言っていいけど４０ぐらいまで引っ張っているプロトコールもあると思う。Ct値がそれより５サイクルほど早ければなんとか図れるのではないかとおもう。 発現が低いから濃度が減っていって図りづらいのではないかと言うのはあまりにも曖昧な感覚のもとでの判断で、（もし、なんコピーぐらいがあるのか、何サイクルぐらいで立ち上がるのか情報があるなら別だがそうでなければ）あまりにもあやふやだと思う。

ｑPCRでごく少ない発現量遺伝子の定量性の考え方 削除/引用 No.6736-1 - 2018/03/03 (土) 13:14:55 - ひよこ 基本的な質問ですが、お願いいたします。 コントロール群と比較群のサンプル間で、ある遺伝子Aの発現を比較するとします。定量性を確保するために、遺伝子Aと内在性コントロールBの検量線を、測定したいサンプルの発現量がカバーされるように引くことで（挟みこむ）、相対的に発現量を比較していました。 今度遺伝子Aのノックアウトマウスでの発現量を見るのですが、WTでも発現量が低いため、増幅が遅いサイクルで起こると予想しています。 この場合、今までのように、測定したいサンプルよりさらに後方に検量線を引くことは難しいのではないかと思います。 普通はどのようにして解析されるのでしょうか？ PCR効率が必ずしもそろっていないので、プレート内に検量線を引いておいた方が無難ではないかと思っています。 今回の実験そのものは、定量性が厳密に必要な実験かと言われれば、そうではないと思いますが、ある程度のは正しい考え方を知りたいので教えていただけませんでしょうか。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---