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(無題) 削除/引用 No.6725-6 - 2018/02/27 (火) 12:43:53 - xyz APさん なるほど。反応の最初と最後では系のバランスが大きく異なるのですね。 昔、サイクル数は少ない方が良いと習ってその通りに実験していたのですが、 ふと考えてみると理屈を理解しておらず変な考えをしてしまいました。 具体的な説明をありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6725-5 - 2018/02/27 (火) 12:32:08 - AP >酵素自体のエラー頻度が一定だとするとサイクル数は関係ないと思いましたが、あまり自信がないです。。。 いや、基質のバランスが刻一刻と変わっていくので、その考えはあたりません。 dNTPが枯渇してくるとエラーレートがあがります。PCR産物が増えるに従って鋳型に対するdNTPの濃度は大きく変わります。 また、サイクル数が多いと酵素も劣化してくるので、意図せぬ副反応が起こるかもしれません。 例えばPCRベースでsite directed mutagenesisしようという場合など、鋳型を多め、サイクル数少なめ（例えば10回以下）で意図せぬ変異が入らないようにするのが普通です。増やすんじゃなくて変異配列を作るのが目的なので、サイクル数を多くするのは得策じゃないからです。

(無題) 削除/引用 No.6725-4 - 2018/02/27 (火) 12:27:25 - xyz 例えば鋳型の長さ100bp、エラー頻度が0.01%だとして、鋳型が100コピーあります。 １回目のサイクルで倍に増えて200コピー中、エラーありが2コピー。 ２回目のサイクルで400コピー中、エラーありが2+4=6コピー。 ３回目のサイクルで800コピー中、6+8=14エラー。 ほんとですね。。。考えが足りませんでした。 素早いご指摘ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6725-3 - 2018/02/27 (火) 12:14:35 - おお 電気泳動できれいにバンドが出るほど増やせばいいです。 エラーもサイクルごとにその頻度で起こるので、どんどん増えていきます。また、変な副産物もサイクル数を重ねて行くほど顕著になってくるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6725-2 - 2018/02/27 (火) 12:04:19 - mon ＞酵素自体のエラー頻度が一定だとするとサイクル数は関係ないと思いました 増幅した合計鎖長を考えれば、関係あるのは明白です。 とは言え、最近の高正確性酵素を用いれば滅多に変異は入りません。 小心者なので数クローン(３クローンくらい)の塩基配列は念のため確認しますけど。

PCRのサイクル数とクローニングエラー 削除/引用 No.6725-1 - 2018/02/27 (火) 11:47:40 - xyz すごく初歩的な質問ですいません。 PCR産物をクローニングする場合、サイクル数は少ない方が良いですか？ それとも35サイクルとか十分に回しても、クローニングで拾えてくるコンストラクト上のエラー頻度は変わらないものでしょうか。 酵素自体のエラー頻度が一定だとするとサイクル数は関係ないと思いましたが、あまり自信がないです。。。 エラーが入ることで増幅効率が上がるかもとは思いましたが、そんな極端に変わるとも思えず。

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