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Asymmetric PCRで大量増幅 トピック削除
No.6711-TOPIC - 2018/02/20 (火) 19:33:52 - xyz
Asymmetric PCRを用いた実験を行っております。
プライマー濃度の条件検討により、1:50の濃度比にて電気泳動レベルでクリアなssDNAを増幅することができました(制限酵素で確認済み)。

しかしこの条件にて大量増幅を行おうとすると、ある程度のサイクル数(25cycle程度)で増幅がプラトーに達しているのか、それ以上増やすことが出来ません。
そこで質問なのですが、Asymmetric PCRにてPCR産物を大量(>10ug)に生成するには、反応系のスケールアップ以外に何か別の方法はないでしょうか。

とりあえず出来る方法として、条件検討時の10ulの系から、200ulの系までスケールアップして実験を進めてみたのですが、あまり賢い方法とも思えません。。。
ご存じの方法が御座いましたら教えて頂けると助かります。
　
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(無題) 削除/引用
No.6711-8 - 2018/02/21 (水) 14:31:31 - AA
T7でも片側鎖消化ができるはずです。

タカラがキットを売ってたと思いますよ。

(無題) 削除/引用
No.6711-7 - 2018/02/21 (水) 10:26:48 - xyz
みなさん
様々なアドバイスありがとうございます。

PCRの反応系としての限界を念頭に改良の余地がないか検討したいと思います。

>もしそうなら、Asymmetric PCRより、lambda exonucleaseでPCR産物を処理した方が、大量調整できますよ。
調べてみるとlambda exonucleaseを使ったキットも販売されているのですね。他にもnickaseを使うキットもありました。

ssDNAの調整にはasymmetric PCRや、lambda exonuclease、nickase、exonuclease III?など色々使えるようですが、
それぞれの特徴(PCRベースかどうかなど)を考慮して、実験に合う方法を模索してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.6711-6 - 2018/02/21 (水) 10:17:25 - AP
lambda nucleaseは初めて知った。
それならexonuclease IIIも使えそうだ。残したい方の鎖が3'末端突出になる制限酵素サイトをプライマーにつけておいて。

(無題) 削除/引用
No.6711-5 - 2018/02/21 (水) 04:36:21 - おお
あまり賢くないといいますけど、必要量取れるなら９６穴でやると９６個分の反応ができるわけだし、それでさっさとssDNAをとって実験してしまうのはそんなにかっこ悪いとはおもわない。

まあただいろいろやってみるというのは科学の面白さでもありますし、そこでちょっとしたものが見つかることはあるとは思いますので、いろいろ考えてみてもいいかもしれませんけど。

例えばリバースをテンプレートの５倍ぐらい加えたらどうなりますかねぇ。ssDNAを安定化させるような試薬とかもあるし。

(無題) 削除/引用
No.6711-4 - 2018/02/20 (火) 23:24:59 - SYBR master
あちゃ〜、文字化けするのか。
20 microgram用意すれば、10 microgramのssDNA作成できます。

(無題) 削除/引用
No.6711-3 - 2018/02/20 (火) 23:23:29 - SYBR master
ssDNAの大量調整ですか？

もしそうなら、Asymmetric PCRより、lambda exonucleaseでPCR産物を処理した方が、大量調整できますよ。

単純に、20 µgのPCR産物用意すれば、10 µgのssDNA作れます。

(無題) 削除/引用
No.6711-2 - 2018/02/20 (火) 21:21:01 - AP
普通のPCRでも一反応せいぜい1 ugが限度じゃなかったっけ？
一反応にdNTPが20 nmol入っているとして全部重合したとしても7 ug くらいにしかならない。

asymmetric PCRで一本鎖を作る場合、鋳型のインプットを多目(例えば100 ng)にしてサイクル数20回くらいが標準だと思う。鋳型に対して10〜20倍くらい産物ができれば、鋳型が残存しても一本鎖プローブとしてのパフォーマンスにあまり影響がないというあたりから(RNA polを用いたIVTによる一本鎖合成のターンオーバーもそれくらい)。
あんまりサイクル増やしても、上記のように基質が有限だし、産物が混み合ってくると、鋳型に対してプライマーと産物が競合して反応を妨げそう。

標準的な反応を10本とか20本とか立てるのが無難。

Asymmetric PCRで大量増幅 削除/引用
No.6711-1 - 2018/02/20 (火) 19:33:52 - xyz
Asymmetric PCRを用いた実験を行っております。
プライマー濃度の条件検討により、1:50の濃度比にて電気泳動レベルでクリアなssDNAを増幅することができました(制限酵素で確認済み)。

しかしこの条件にて大量増幅を行おうとすると、ある程度のサイクル数(25cycle程度)で増幅がプラトーに達しているのか、それ以上増やすことが出来ません。
そこで質問なのですが、Asymmetric PCRにてPCR産物を大量(>10ug)に生成するには、反応系のスケールアップ以外に何か別の方法はないでしょうか。

とりあえず出来る方法として、条件検討時の10ulの系から、200ulの系までスケールアップして実験を進めてみたのですが、あまり賢い方法とも思えません。。。
ご存じの方法が御座いましたら教えて頂けると助かります。
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