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(無題) 削除/引用 No.6709-6 - 2018/02/21 (水) 10:19:04 - X 組織切片の蛍光染色の定量の場合、同一スライドに比較したい組織切片とポジコン（できれば、ある程度均一な発現が確認されている培養細胞ペレットを包埋して切片にしたもの）を全てのせて同時に染色し、高速自動スキャン可能な蛍光顕微鏡で撮影する、といったあたりが現時点での限界と思っています（あくまで私の所属する施設での話で、蛍光定量を突き詰めている施設では、もっと良い方法があるかもしれません）。それでも、染色の均一性などは担保できないので、他の方法も合わせた議論で定量性の評価はするべき（特に論文投稿の場合は）と、個人的には思っています。

(無題) 削除/引用 No.6709-5 - 2018/02/21 (水) 01:15:40 - 胃 私もPCRさんと同じ意見を持っています。時々蛍光画像で発現の比較する方もいらっしゃるようですし、上司からも比較するよう言われたこともありますが、難しいように思います。顕微鏡のコアファシリティーの方に聞きますと、同一条件で染めて、同一条件の露光で撮れば比較できるよ、と言われましたが、難しいですよね。サンショウウオさんのおっしゃるように同一視野内にサンプル2つ入れたいですけど・・・それも難しいですよね。もし比較された方がいましたら私も方法を聞いてみたいです。

(無題) 削除/引用 No.6709-4 - 2018/02/20 (火) 22:54:28 - １q２w３え４r5 いろいろなご見解お伝えくださりありがとうございます。 検体は組織切片で、はじめ酵素抗体法(DAB)で検出してImage Jで定量していたのですが（比較する切片は全工程同時に行い、DABの反応時間も同じにしました、一応いい感じでそまったのですが、DABでなくて免疫蛍光染色で定量してほしいと言われたました。でも、長く観察していればそれだけ退色しますから、蛍光あててる時間が違えば画像Aのシグナルを画像Bのシグナルよりも好きなだけ弱く見せることもその逆もできしまうことになるし、それだとなんでもありになってしまうと思って、それで、みなさんはどのように定量してるのか聞きたくて質問しました。

(無題) 削除/引用 No.6709-3 - 2018/02/20 (火) 18:32:24 - サンショウウオ 撮影までに要した露光・照射時間揃えればいけるのでは？　とおもったけど、かなり厳密にやるのは大変かも。 画像間の定量比較をしたくないなら、同一の視野内に2種のサンプルを置くようにくふうして、比較するしかない。細胞なら、目的のタンパク質を緑色蛍光で染色しておいて定量比較したい場合、片方のどっかを赤、もう片方を青とか別の色で染色しとけば区別できるのでいける。

(無題) 削除/引用 No.6709-2 - 2018/02/20 (火) 02:58:59 - PCR （少なくとも現在は）出来ない、が私の中の結論です。 >画像Aのシグナルが画像2のシグナルのーーー倍、のような感じ。 線形性を保つような、かつ再現性のある条件が見つかればそりゃ出来るんでしょうけど、無理ですよね。仰られる通り、退色の問題もあるし。サンプルのフレッシュさのほんの小さな違いで結果が変わったりするし。 WBでハウスキーピングをローディングコントロールにするけれど、それと似たようなものが蛍光顕微鏡画像においてもあるならばなんとかなるかもしれないけれど、そんなものも無いし（以前、DAPI染色をそれに使うというアイデアを聞いた時は一瞬なるほどと思ったけれど、DAPIも別に常に同じ蛍光強度なわけじゃないし）。 でも、蛍光を定量的に計って比較しましたってデータはたまに見かけることがありますね。知り合いのボスは、論文レビューのときにそういうデータ出して来るグループは信頼しない、どうやってvalidationしたのかきっちり聞くようにしているが、まともな返事を書いてきたのは一つも無い、と言っていました。

画像の定量比較 削除/引用 No.6709-1 - 2018/02/19 (月) 23:13:07 - １q２w３え４r５ ２つの蛍光顕微鏡画像を定量的に比較することは可能ですか。（画像Aのシグナルが画像2のシグナルのーーー倍、のような感じ。 蛍光の場合、退色の問題があるので、その辺をみなさんはどのようにコントロールされているのか知りたいです。

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