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(無題) 削除/引用 No.6702-28 - 2018/02/24 (土) 09:16:47 - おお コンタミ、ノンスペ、もう一つの可能性も指摘されてますよね。

(無題) 削除/引用 No.6702-27 - 2018/02/24 (土) 00:17:29 - 煎餅 おお様、 No RT controlへのcDNAのコンタミの疑いという理解で良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6702-26 - 2018/02/23 (金) 17:41:39 - PCR初心者 別のトピでも書きましたが、例えばマウスのβactin遺伝子の場合は、完全長cDNAが別の遺伝子に組み込まれているので、qPCR用のイントロンを挟んだプライマーでもゲノムDNAから目的のサイズのPCR産物が増幅されます。

(無題) 削除/引用 No.6702-24 - 2018/02/23 (金) 17:35:10 - xyz >Master Mixとサンプルの混合の仕方はどのようにしていらっしゃいますか。 当然、１）cDNA抜きのMaster Mixをプレートにまずまいてしまって、その後cDNAをウエルごとに入れて行く方法です。なぜなら、反応液のコピーを作る目的として、混合の際のバラつきを平均化する、という目的もあるからです。ピペットで吸い上げたcDNA溶液が常に一定量であるとは限りません。ピペットの精度上、ある程度はバラつきます。なので、２）の方法は基本的に推奨されません。

(無題) 削除/引用 No.6702-23 - 2018/02/23 (金) 14:07:45 - 煎餅 おお様、 ＞あるならそれでやってみて増幅効率が改善されたらRNAの精製とか逆転写などの反応とかに問題があるといえるし、原因の絞り込みをしやすくなるだろうということです。 そのとおりですね。やってみます。 ＞イントロンを含んだ長いProductsが検出されたということ？そうでなければゲノム由来と言えないですよ？ No-RT のサンプルで増幅を確認しました。イントロンを含まない、目的のアンプリコンと同じサイズです。増幅曲線の傾きは他のスタンダ―ドとは異なっていました。どういう解釈になるのか、考えましたが分かりませんでした。もう少しヒントを頂けませんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6702-21 - 2018/02/23 (金) 13:26:54 - おお >[Re:16] 煎餅さんは書きました : > おお様、 > > ありがとうございます。考えていませんでしたが、それは一つの案ですね！とりあえず原因が手技の問題に絞ることができましたので、今回は手持ちのcDNAで改善する方法を探ってみます。 もしそれが原因だったらまあそれでいいんだけど、テンプレートになるDNAがあるならそれでやってみて増幅効率が改善されたらRNAの精製とか逆転写などの反応とかに問題があるといえるし、原因の絞り込みをしやすくなるだろうということです。 >しかしそもそも長いイントロンを挟むか、スプライシングサイトを挟んでプライマー設計をしているはずなのに、なぜgenomic DNAから増幅が起こってしまうのでしょうか。 >泳動ではアンプリコンのサイズは目的のものと同一と思われました。 イントロンを含んだ長いProductsが検出されたということ？そうでなければゲノム由来と言えないですよ？

(無題) 削除/引用 No.6702-20 - 2018/02/23 (金) 12:01:47 - AP イントロンを挟むというのは検出された産物がcDNA由来かゲノム由来かを検証するのに役立つけれど、ゲノムからの増幅を防ぐ効果は期待しないほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.6702-19 - 2018/02/23 (金) 11:57:19 - AP 完璧にゲノムDNAを除く方法はない、と思っていい。DNase処理もしかり。 程度の問題。

(無題) 削除/引用 No.6702-18 - 2018/02/23 (金) 11:34:13 - 煎餅 新たなトピックを立ててうかがった方が良いのかもしれませんが、追加で質問させてください。 前に記述いたしましたように、SYBR Greenのプライマーチェックをしたときに、genomic DNAのコンタミがわかりました。しかしそもそも長いイントロンを挟むか、スプライシングサイトを挟んでプライマー設計をしているはずなのに、なぜgenomic DNAから増幅が起こってしまうのでしょうか。 泳動ではアンプリコンのサイズは目的のものと同一と思われました。自分が調べた5つのプライマーから5つとも同じ現象が起こりました。このデザインはのうち4つは論文にて既に使われているものです。 勿論DNase treatmentをした方が良いでしょうし、せざるを得ないと思いますが、私がDNase I のキットを使ってみたところ、RNAの回収率が5から6割程度でした。これは妥当な回収率なのでしょうか？ 無知で申し訳ありませんが、ご回答どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.6702-16 - 2018/02/23 (金) 11:02:24 - 煎餅 おお様、 ありがとうございます。考えていませんでしたが、それは一つの案ですね！とりあえず原因が手技の問題に絞ることができましたので、今回は手持ちのcDNAで改善する方法を探ってみます。

(無題) 削除/引用 No.6702-15 - 2018/02/23 (金) 10:56:23 - 煎餅 xyz様 ありがとうございます。 おっしゃる通りです。水で希釈したうえで2ulであるので、大きな問題ではないと考えていました。 ところで、それに関連して、もしよろしければ教えていただきたいのですが、Master Mixとサンプルの混合の仕方はどのようにしていらっしゃいますか。 具体的に言いますと、１）cDNA抜きのMaster Mixをプレートにまずまいてしまって、その後cDNAをウエルごとに入れて行く方法と、2）Master Mixをトリプリケイトごとに分けてそこでcDNAを混合してしまって、10ulずつプレーティングしていく方法。細かいことでどちらでも良いのだと思っていますが、何かコメントなどがありましたら教えていただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.6702-14 - 2018/02/23 (金) 10:44:31 - 煎餅 question様 示唆に富むご回答ありがとうございます。ご返信が遅くなってしまいました。 > b)（失礼ながら）質問者様の手技が悪くて再現が出来ない 私もそう考えて一度コアの方にランをお願いしました。その際に効率が悪いのでこれは私の手技以外の問題だろうと思っていたのですね。 でも、考えてみたらこれはSYBR　GreenのGAPDHを使って試していたのです、Taqmanではなく。それは当施設内の他のPIから頂いたもので、ΔΔ法を使っていたのでてっきり効率は問題ないと思い込んでいました。 しかし確認したらそのPIは自前のSYBR Greenのプライマーの効率チェックをしないままΔΔ法に使っていたらしいことが判明しました。 そして今回新しく、前任者の残したｃDNAと私が前任者の残したRNAから合成したｃDNA を使って、私のTaqmanと試薬でコアの方に再度試行して頂きました。すると、効率は問題なく、ワークしました！・・・ということで、問題は私の手技にあったんですね・・・。SYBR　Greenのプライマーのデザインはさておき。具体的な操作として何が悪いのかまだわからないのですが、ピペットやチップは今までと違うのでそのあたりも含めて、再度考えてみます。お騒がせして本当に恥ずかしいです。 > ところで、Taqmanでダイマーが出ていないというのはどうやって確認されたんでしょうか？ ご指摘ありがとうございました。これは私の思い込みによる誤りでした！申し訳ありません。プレデザインのTaqmanにダイマーが出るということを全く考えておりませんでした。そこで泳動してみたところ、アンプリコンと思われるバンドのほかに、小さいサイズのあたりにスメアがあり、ダイマーではないかと思いました。 コアのディレクターに質問したところ、普通は泳動はしないからはっきりとは言えないけれども、アンプリコンと思われる増幅が確認できているし、ダイマーができていたとしてもあきらかにそれよりもかなり小さいサイズであり、また、プローブで識別しているから、検量線を描いて特に問題がないようであればこのプライマーで良い（私の英語の理解が正しければ）のようなことを言われました。その理解で良いのでしょうか、もしよろしければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.6702-13 - 2018/02/20 (火) 17:38:37 - おお いちどDNAをテンプレートにしてやってみたら？

(無題) 削除/引用 No.6702-12 - 2018/02/20 (火) 10:43:09 - xyz 手順等の細かいことは置いておいて >10ulのｑPCRの系の時にはｃDNAは2ul入れることにしています。 濃度が不明なのでなんとも言えませんが、テンプレートの添加量がPCR反応液容量の10％を超えています。 例えばTakaraのSYBRE Premixだと、25ulの系でtemplate 100ng以下、添加量10%以下が推奨されています。 この点、あなたが使用した反応系では問題ありませんか？

(無題) 削除/引用 No.6702-10 - 2018/02/20 (火) 06:31:57 - question 1）もともと前任者が残したRNA、cDNA、Taqmanでうまくワークするのか最低限確認しようと思ったら、それすらできなかったという流れです。 前任者の残したモノでやってみたが、再現できなかった、ということですね。であれば、 a)前任者のやり方（残していったデータ）が悪い（最悪は、全て捏造。でなければ、5回に一回だけ上手くいったチャンピオンデータだけ残していった、とか）からやっても無駄 の可能性か b)（失礼ながら）質問者様の手技が悪くて再現が出来ない かのどちらかということになりますよね。Xさんが指摘されているように、そこを見極めるのは大事だと思います。 その上で、Taqmanではダイマーが出来ていない、GAPDHでは発現効率が（許容範囲と言える）94%なのだから、前任者は最低限度のところまでは出来ていると考えてもいいものでしょうかね？その前任者のGAPDHのデータが本物であれば、そう考えざるをえないように思います。 であれば、問題は質問者様のほうにあるとして、しかもGAPDHでもダイマーが出来たという話だから、いくつか発現の多いものに関してプライマーを設計し直してみてはどうでしょうか？ 発現の低いものに関しては、自分の経験で言うと、効率がわるくなったりすることはよくあることのように思いますので、それらに対しては希釈倍率を下げるなりして対応するほうが早いような。 ところで、Taqmanでダイマーが出ていないというのはどうやって確認されたんでしょうか？ 2）発現量が多くても多くなくても80％切ります。SYBR Greenを試したときに中には良いものも3，4個あり、それだけは90％以上でした。しかしプレデザインのTaqmanで80％切るということは普通無いのではないかと思うのですがいかがでしょうか？ やったものほとんどで効率が悪いならば、私だったら全てに共通する試薬の中におかしなものがある可能性を疑います。cDNAを最後にeluteするのに使ったBufferとか。あるいはSYBR Green mixそのものが古いとか。プライマーの設計よりも先にこちらを疑う方が先だと思います。 書いておいてなんですが、かなり無責任なことを言っているような気がして来ました。あまり参考にならないことを書いているので、こんなことを言っている奴もいるな、位に留めておいて下さい。

(無題) 削除/引用 No.6702-9 - 2018/02/20 (火) 05:19:32 - 煎餅 X様 ご回答ありがとうございます。 今すべてを確認できなくて申し訳ないのですが、すくなくとも前任者のGAPDHの増幅効率は94％程度でした。 > 前任者が残してくれたcDNA (RNAではなく）を用いて、前任者さんと全く同じ条件でPCRをかけた場合、その５段階希釈の範囲内でも増幅効率が80%を切ってしまうという事でしょうか？　全く同じ条件でコアの方にもやってもらったという事でしょうか？ 残っていたcDNAと RNAをそれぞれ使い、確認できる範囲ではほぼ同じ方法でやってみました。前任者は既に他国に帰国し、さらにおそらく実験の経験がそれほどないようで、本人に質問しても今ひとつハテナ？というところがあり・・・ コアの方にやっていただいたときは私の作ったサンプルでした！前任者のものを使って依頼してみた方が良いでしょうね。 > チップと水をかえたくらい、とおしゃってますが、文面を見ると、TaqmanからSYBR greenへの変更は明らかですし、RNA抽出法も、前任者さんは「Trizol-LSをベースに更に手を加えた方法」を用いていたのに対し、質問者さんは「自分のTrizol の標準的な方法で作ったRNA」を用いてらっしゃるのですよね？ RTの方法は前任者さんと同じですか？　前任者さんがTaqman PCRで使っていたプライマーでもダイマーになりますか？ 私の書き方が悪く、申し訳ありません。 私はできるつもりでSYBR　Greenで実験を始めたのですが、途中で何かおかしいと思い、色々と変え続けたあとで、やっと前任者と同じ方法、同じものを使うという、基本的な確認を行ったのです。その時に確実に違ったのが水とチップという意味でした。 Taqmanではダイマーはできず、効率が悪いだけです。

(無題) 削除/引用 No.6702-8 - 2018/02/20 (火) 04:58:11 - 煎餅 AP様 ご回答ありがとうございます。 TAKARAのEasy dilutionを試してみましたが、あまり根本的な解決にはいたりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6702-7 - 2018/02/20 (火) 04:55:52 - 煎餅 question様 ご回答ありがとうございます。そして説明が要領を得ていなくてすみませんでした。 1)前任者の行た実験は、 ControlとcKOマウス大脳からのサンプル集め、RNA抽出、RNAシークエンスコアへの提出、同じRNAの一部よりcDNAの作製と数回のお試しのqPCRです。 前任者はTaqmanを使っていましたが、私がもともとSYBR Greenを行ったことがあるため、ボスがSYBR Greenの系を作ってほしいということでした。 さて、私の行った実験ですが、 もともと発現量が多くないTdtomato発現細胞で拾うため、FACSソーティング後の回収量及びRNA量は多くはないであろうと思い、まずコントロールのサンプルとしてWTマウスの大脳よりRNAを抽出、cDNAを合成しました。SYBR Greenのプライマーを新しくデザインし、その効率の確認をし、ワークしたものから比較したいサンプルを実際に使って実験を行いたいと思いました。 しかしその結果が思わしくないので、最初はSYBR greenのプライマーデザインの問題ではないか、ゲノムのコンタミではないかなど、色々と調べていたのですが、うまくいきませんでした。 そこで、もともと前任者が残したRNA、cDNA、Taqmanでうまくワークするのか最低限確認しようと思ったら、それすらできなかったという流れです。今となってはこちらをはじめにするべきでしたが、前のラボではあっさりとqPCRができていたので、過信していました。 前任者の実験手技などはこの目で見ておらず、実験ノートとデータを見て彼の主張をきいただけですが・・・信頼できるのでしょうか、とおっしゃるのはどういうことでしょうか？ 2） プライマーダイマーが出来ることと、効率が100%前後にならないことは別事項として捉えた方が良いと思います。 おっしゃるとおりですね。私もそう思います。書き方が悪かったですね。 今は効率の問題に絞りたいです。 そうですね、発現量が多くても多くなくても80％切ります。SYBR Greenを試したときに中には良いものも3，4個あり、それだけは90％以上でした。しかしプレデザインのTaqmanで80％切るということは普通無いのではないかと思うのですがいかがでしょうか？ 以上、まだわかりにくかったら申し訳ありませんが、返信お願いできれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.6702-6 - 2018/02/19 (月) 10:46:20 - X 前任者さんが行った、５段階希釈のTaqmanではうまく行っていたとの事ですが、この時の増幅効率はどのくらいだったのでしょうか？ 前任者が残してくれたcDNA (RNAではなく）を用いて、前任者さんと全く同じ条件でPCRをかけた場合、その５段階希釈の範囲内でも増幅効率が80%を切ってしまうという事でしょうか？　全く同じ条件でコアの方にもやってもらったという事でしょうか？ 前任者の結果の再現性の問題なのか、新たに加わった要素（SYBR greenの使用や、新規のRNA抽出、RTに伴う問題など）によるのか、見極めるのが第一歩のように思います。が、Taqmanで80%を切る状況は、いずれにせよ改善する必要がありますね。 チップと水をかえたくらい、とおしゃってますが、文面を見ると、TaqmanからSYBR greenへの変更は明らかですし、RNA抽出法も、前任者さんは「Trizol-LSをベースに更に手を加えた方法」を用いていたのに対し、質問者さんは「自分のTrizol の標準的な方法で作ったRNA」を用いてらっしゃるのですよね？ RTの方法は前任者さんと同じですか？　前任者さんがTaqman PCRで使っていたプライマーでもダイマーになりますか？

(無題) 削除/引用 No.6702-5 - 2018/02/19 (月) 07:41:55 - AP 吸着ロスを防ぐために、希釈液には適当なキャリア(tRNA、linear acrylamideなど)を添加しておく。市販の希釈用液もあります。

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