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(無題) 削除/引用 No.6684-9 - 2018/02/15 (木) 05:52:44 - おお >(2)0.2um PVDFをメタノール30sec⇒DDW1min⇒ブロッティングバッファー10分〜で処理した後ブロッティングしています。また、ゲルも一度ブロッティングバッファーに浸しています。 トランスファー前にメタノールを含むバッファーに漬けると蛋白の固定化が進みトランスファーされにくくなるような気もします。

(無題) 削除/引用 No.6684-8 - 2018/02/15 (木) 05:47:39 - おお ２５分て結構短いとおもいます。一時間ぐらいまではなんとかなるんじゃなかな。温度が上がらないなら９０分ぐらいまでなんとかなる。CBB染色はWBの感度に影響を与えやすくなかったっけ。。。 同じ条件でニトロセルロースで検出できていたなら、その中途半端な転写効率でも検出できたということになるので、転写効率がもんだいなのかなぁと漠然に思ったりもします。 キャパも減るかもしれませんが、ゲルを薄くするといいかもしれません。バッファーもアルカリに振るほうが移りやすいと思います。ちょっと前にそのような話をしたんですが、いま探しきれません、、、バイオラッドとかがいろいろなバッファーシステむを紹介しています。セミドライなら陰極と陽極で違うバッファーを使うような物もあり、好んでそれを使っている人もいるようです。 やった事がない裏技としてはゲル内のイオン強度が低いほうがものが移動しやすいので、５分ぐらい低イオン強度のバッファーでにつけて振盪するとか。５mM TrisCl, （pH８．３） ０．１％SDSとかかな。

(無題) 削除/引用 No.6684-7 - 2018/02/15 (木) 01:51:41 - wせdfrgtひゅ そうですね。私は30%MeOH/10%酢酸でやってますが、これだとわりといい感じのスピードで脱色が進みます（でも震盪器に放置せず自分で見ながら脱色してください）。これ以下だと脱色がうまく進まないかもしれないので30%くらいが下限とおもいます。バックがまだ青いうちに水に移すのがポイントです。

(無題) 削除/引用 No.6684-6 - 2018/02/15 (木) 00:21:44 - 棒君 ご丁寧にご教示いただきありがとうございます。PVDF用の組成もあるのですね…！ 今回はいくつか調べたうちMeOH40％＋酢酸10％を使用しています。たしかに目視しながら脱色したのですがかなり急速に脱色され乾燥前からバックグラウンドも白めでした。恐らく転写されていないのではなく脱色しすぎなようですね… 今ざっと調べたところPVDFでも40〜50％MeOHを使用しているプロトコルが多い（BioRad, ｺｽﾓﾊﾞｲｵ,アトーなど）のですが、メタノール濃度はもう少し低い方が良いのでしょうか？ とりあえずまずは脱色しすぎないよう注意して再度実施したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6684-5 - 2018/02/14 (水) 23:13:00 - wせdfrgtひゅ CBBstainの染色液はPVDF膜用の処方でしょうか。脱色液メタノール濃度が高かったり、脱色時間が長いと、染色されたバンドの色もかなり落ちてしまうことが多いです。脱色はタッパーを手でふりつつ脱色中の膜を見ながら行い、　バックの濃い青が少し落ちてきて、主要なバンドがそれなりに見えてきたら（染色時間とか液量とかにもよるけど、染色時間が長過ぎでないならば、脱色はせいぜい数分からMaxでも10分以内にとどめる）、バックがまだけっこう青くても構わないので（このいい感じのところで止めるタイミングは慣れというか感覚的なものがあって説明しずらいのですが、とにかく脱色しずぎないように気を付けるのが重要です。）、脱色液から水に変えて少しすすいだらキムタオル等の上に転写面を上にして放置して室温で自然乾燥させて下さい。急ぐならばヘアドライヤーをクールの状態で少し離して当てるとよいです。膜は濡れた状態ではけっこう青くても、完全に乾燥するとバックはかなり白っぽくなります。それで濡れていたときはみえなかった薄いバンドまで見えてきます。バックの色が白っぽくなるまで脱色してしまうと、バンドの色も落ちてしまい、乾燥後の膜には蛋白質ほとんどなにも染まっていないことになります。 もちろん、色素がとれただけで蛋白質自体は膜上に残っていますから再染色は可能ですが、完全に乾燥してしまうと膜の染まり方が不均一になってしまうことがあります。なので一度100%メタノールに沈めて親水化してから水で数回あらい、再染色した方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.6684-4 - 2018/02/14 (水) 21:16:42 - 棒君 早速のご返答ありがとうございます。 Mon様 (1)(3)につきましては一般的な単一のブロッティングバッファー(25mMトリス192mMグリシンin 15%メタノール)で行っております。 (2)0.2um PVDFをメタノール30sec⇒DDW1min⇒ブロッティングバッファー10分〜で処理した後ブロッティングしています。また、ゲルも一度ブロッティングバッファーに浸しています。 wせdfrgtひゅ様 確かにタンパク質の種類によっては、ということはありえそうですが今回はCBBで全てのバンドが見えていないので、サンプルのブロッティング自体が上手くいっていないという気がしています。 現状改善点としてはタンパク質のゲルからの溶出を上げるためMeOHを5-10%にしSDSもブロッティングバッファーへ添加するくらいでしょうか、明日試したいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.6684-3 - 2018/02/14 (水) 20:52:51 - wせdfrgtひゅ 比較的少数ですが、性質上PVDF膜にトラップされにくい蛋白質もあるらしいです。もちろん逆もあるみたいです。buffer組成など転写条件の工夫であるていど改善はされるみたいですが。

(無題) 削除/引用 No.6684-2 - 2018/02/14 (水) 20:46:20 - mon いくつかProtocolでわからないところがあります。 (1)３液組成のブロッティングバッファーではなく1液組成のProtocolなのか。 (2)PVDF膜をMetOH等で親水処理してから、転写バッファーに置換しているか。 (3)ブロッティングバッファー：15％メタノール、0%SDSって、緩衝液（塩）は含まれないのか。

PVDFのブロッティング転写効率 削除/引用 No.6684-1 - 2018/02/14 (水) 19:51:12 - 棒君 お世話になっております。 普段はニトロセルロースでウェスタンをしていたのですがこの度初めてPVDFを使う試験を行っております。ニトロセルロースで上手く働いていた抗体がPVDFでは光らなかったため、ブロッティング後に転写効率を見ようとゲル・メンブレンをCBB染色しました。 すると、ゲル側に高分子量-低分子量までサンプルのバンドがあり、メンブレン側ではサンプルのバンドは認められませんでした。しかし、有色マーカーは200-30kDaまでメンブレンに転写されていた(ゲル側にほぼ残りなし)という些か奇妙な事態に陥っています。 このようにラダーは転写されるがサンプルは転写されないという事象はどのようにして生じるのでしょうか。ご教示いただけますと幸いです。 また、条件は下記のもので実施しました。 ゲル：10％アクリルアミド ブロッティング：セミドライ式15V, 25分 ブロッティングバッファー：15％メタノール、0%SDS サンプル：肝ホモジネート＋Laemmli sample buffer

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