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(無題) 削除/引用 No.6663-9 - 2018/02/09 (金) 05:31:42 - GFP 1）どの臓器で（GFPではなくて）目的のタンパクが確認されたのかわからないのですが、目的タンパクに対する抗体でWBしてもバンドの検出はどの臓器でも出来なかったということでしょうか？ 仮に出来なかったとして、その上でGFPに入れ替えたりするのってなんか不毛な気がするのだが。 それと、入れ替えたっていうのは、homologous recombination（または二段階CRISPRとか？）で入れ替えてマウスまで作ったということですか？なにか勘違いされていないでしょうか？ 2）発現量の違いに関しては明記されていないのですが、タンパクが確認できなかった臓器でのmRNAの発現量はどんなものだったんですか？単純に、タンパクが確認できた臓器に比べて、mRNAの発現量がかなり低かったりはしないのですか？

(無題) 削除/引用 No.6663-7 - 2018/02/08 (木) 19:04:49 - おお >さらに3´UTR領域をgfpの3´UTR領域に置き換えてから この結果で３UTRが翻訳活性に影響しているっていう考察をしないのはなぜですか？ GFPを入れたのはどこですかゲノムに直接ではなくってそういう発現ベクター用のプラスミドですか？ならスプライシングされないような形になってませんか？それによって可能性が絞られたりしますよ。 まず実験を正確に把握してください。

(無題) 削除/引用 No.6663-6 - 2018/02/08 (木) 18:11:53 - AP 塩基長はなんで判断しているんですか？　アガロースゲル電気泳動レベル？ RT-PCR? Northern? 実際のところ、長さがほとんど同じスプライスヴァリアントも、未記載のヴァリアントの存在もあり得るので、まず配列を確認するのが先決かと思います。 一本鎖の塩基長を表すのにはnt (nucleotides)がよいかな。

(無題) 削除/引用 No.6663-5 - 2018/02/08 (木) 17:42:54 - 名無し 最初、前者は選択的スプライシングによりタンパクの型が異なるため、そのウェスタンで使った抗体が、前者の臓器から産生されたタンパクには適用できず、検出できなかったーーと考えたのですが、mrnaの塩基長が同じであるため、選択的スプライシングが起きたならばmrnaの塩基長は異なるのでは？ と思い、わからなくなってしまいました。 後者は、3´UTR領域を弄っているため、局在や翻訳調節ではないか、と一応の目処は立っています(誤っていれば訂正していただけると助かります) なので、前者はmrnaが存在するのに翻訳されない、輸送、局在、分解、翻訳調節辺りに問題があり、開始コドン〜終始コドンまでをgfp配列に変えれば正常にgfpが作られることから、開始コドン〜終始コドンまでに翻訳されるための司令に関与している(抑制している？)ものがあるのではーーと考えたのですが、調べても開始コドン〜終始コドンまでで翻訳を調節していると書かれている場所が見つからないため、皆様にお助け願いました。 他に条件等でわからないことがあればお聞きください。

(無題) 削除/引用 No.6663-4 - 2018/02/08 (木) 17:30:39 - 名無し 申し訳ありません。 前者は開始コドン〜終始コドンまでにgfp遺伝子の導入ではなく、「置き換え」でした。大変失礼しました。 皆様の素早い回答ありがとうございます。 ＞塩基長だけですか？　配列は？ mRNAの場合、塩基対数 bpはおさまりが悪いですね。 失礼しました、単位はb(ベース)でした(実際kb)。 塩基長のみ同じということがわかっておりまして、配列は明示されておりません。 別々の臓器から粗抽出液を取りだしウェスタンブロットとノーザンブロット後、前者と後者では他の臓器と同じく目的タンパクのcdnaプローブを用いて同塩基長のmrnaが確認されたものの、前者では開始コドン〜終始コドンの間をgfpに置き換えないと、後者では開始コドン〜終始コドンまでをgfpに置き換え且つ3´UTR領域もgfpの3´UTR領域に置き換えないと、目的タンパクをコードしていた部分から産生される(置き換えた後はgfpに対する抗体で検出、つまりgfpを検出)タンパクを確認できませんでした。というのが一連の流れです。説明不足ですみませんでした。 ちなみに、他の例となる臓器でもgfp置き換えはやっており、二つの置き換え方法でどちらもgfpとmrnaは確認されています。

(無題) 削除/引用 No.6663-3 - 2018/02/08 (木) 16:40:31 - mon 翻訳調節でググルと ttps://seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2016.880135/data/index.html

(無題) 削除/引用 No.6663-2 - 2018/02/08 (木) 16:36:32 - AP >別の臓器と同じ塩基対数のmrnaが存在するのにも関わらず、 塩基長だけですか？　配列は？ mRNAの場合、塩基対数 bpはおさまりが悪いですね。

細胞型の違いによるタンパク発現 削除/引用 No.6663-1 - 2018/02/08 (木) 16:23:42 - 名無し 臓器が異なることによってmrnaの発現等異なることは知っているのですが、別の臓器と同じ塩基対数のmrnaが存在するのにも関わらず、他の臓器で確認されたタンパク質が発現しないことは何が原因だと考えられるのでしょうか？(局在、分解調節？) 原因特定のため、一方の臓器は目的タンパクの開始コドン〜終始コドンの間にgfp遺伝子を導入→mrna発現させ、gfpの抗体で確認したところバンド確認(gfp導入前に目的タンパク抗体でウェスタンしたところ確認できず) もう一方の臓器は前者と同じことをしてもバンド検出できず、さらに3´UTR領域をgfpの3´UTR領域に置き換えてからウェスタンブロットするとようやくバンドが検出されました。 両者、何が原因で目的タンパクのみ(gfp導入前)ではウェスタンブロットにおいてバンドが確認できなかったのでしょうか？

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