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(無題) 削除/引用 No.6648-2 - 2018/02/04 (日) 23:25:29 - おお ゲルはプレキャストで４％からのGradientとか買えば解決しそうですが。。。 ゲルの厚さが１．５ミリなら６％でも扱いにあまり苦労はしないでしょう。もっと低くてもできないことはないですが、要領をえないといろいろトラブルが起こる可能性は高くなってきます。７％ぐらいならもっと楽ですし微妙な分子量変化が関係ないなら７から８％でもできると思います。ローディングコントロールをどうするかなどでもゲル濃度の選択が変わるかもしれません６％ならバイオラッドの３７kDaが一番下ぐらいに来るかな。なのでアクチンはほとんど一番下に近いぐらいの場所。GAPDHはもうちょっと小さかったと思うので、、、 トランスファーはWetでO/Nなら２０％メタノールTrisGlycine （pH８．３、えっと３ですよね。４かな）のよく使われるトランスファーバッファーで十分です。セミドライならバッファーは一緒にするかもしれませんが、１０％にメタノールを下げて、ゲルは６％でやると思います。どちらにしてもわたしならSDSを入れるとか細工はしません。膜も一般的にそのサイズならどちらでもいいです。抗体との相性があれば別ですけど。すり抜けるのがしんぱいならPVDFにしとけばいいかと思いますが、そのサイズだとそこまで心配はしませんねぇ。ただニトロセルロースで０．２ｕmポアサイズのものを標準で使ってますので、よく使われる０．４ｕmでの感覚ではありませんが、それで違いが極端に出てくるのは多分小さいサイズのほうかと。 まあ一般論でそのサイズの蛋白ということで。あと抗体が非常にいいならトランスファーの効率に左右されず検出ができたりもしますので（定量性とか細かいところでは不安もあるかもしれませんけど）、うまくいくときはベストでない条件でもうまくいったりすることも。

Ki67のウェスタンブロッティング 削除/引用 No.6648-1 - 2018/02/04 (日) 14:57:07 - pico 今論文のリバイズ中なのですが一人のレビュアーからKi67のウェスタンブロッティングをリクエストされています。分子量の高い蛋白を扱うときの条件(低濃度アクリルマイドジェル、Wetトランスファー、低濃度メタノールあるいはメタノールフリーのトランスファーバッファー、SDSをトランスファーバッファーに加える、Overnightトランスファー)についてはおよそ知っておりある程度のの経験もあるのですが、今回300kDを超える蛋白で今までのように適当に条件を決めてすんなりといく自信がありません。かといって色々と条件を検討する時間的余裕もありません。どなたかKi67のウェスタンブロットをやった経験がありかつ綺麗なバンドをだされた経験のある方はいないでしょうか ? その時の条件(何%ジェル、PVDF or Nitrocellulose, トランスファーバッファの組成、トランスファーの条件)を教えていただければ助かります。

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