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(無題) 削除/引用 No.6648-22 - 2018/02/07 (水) 18:31:38 - pico 分子量の非常に大きい蛋白はバンドはだせても定量がなかなか難しい(シャープなバンドがでにくいってことかな?)ということを言ってる人をみたことがありますが、経験上そこらあたりはどうですか ?

(無題) 削除/引用 No.6648-21 - 2018/02/07 (水) 15:57:08 - PD gelは5-20%のGradientです。この条件で250kdaのマーカーはくっきり残っていますし、190, 230kdaあたりのタンパクは少なくともはっきりでます。が、280kdaあたりだと出たりでなかったり。膜との相性があるのかは不明です。 >[Re:5] picoさんは書きました : > ぉぉ様、PD様 > アドバイスありがとうございます。 > > PD様 > 具体的な条件を教えていただいて非常に参考になります。 > Gelは何%を使用されていますか ? > あとOvernightトランスファー(20-30V)を試されたことはございますか? そちらのほうが短時間でやるよりいいとおっしゃる方もいるようなので。

(無題) 削除/引用 No.6648-20 - 2018/02/07 (水) 15:24:47 - mon >すると低分子蛋白でも問題なくバンドをだせるようになりました。これって抗体との相性とかなんですかね ? 抗体ではないですが、C末に融合させたStrep-tagIIをストレプトアビジン-HRPで検出する際に、マニュアルにニトロセルロース膜を使えと記載があったのを忘れて、うっかりPDF膜を使った検出出来なかった経験があります。同じサンプルをニトロセルロース膜に転写したら問題なく検出できました。 エピトープとの相性はあるようです（べったりPVDFに吸着する？）。

(無題) 削除/引用 No.6648-19 - 2018/02/07 (水) 14:01:54 - おお >あとこれは自分の中ではかなり確信をもった考えなんですが、特定の分子量マーカーがきれいに転写されることと、同じくらいの分子量を持つ目的の蛋白がしっかりとメンブレンに転写されること(要は最終的にいいバンドを得られる)とは必ずしもイコールではないということです。 バイオラッドのPrestainのマーカーは通常の条件などでも写りはいいという感触があります。他の蛋白よりいいとおもえます。なのでわたしはマーカーがゲルに残っているような条件では蛋白のTransferはもっとあやしいなぁというぐらいの指標で見てます。 またわたしは個人的にうまく行っている条件から必要があればちょっとづつModifyするので、そういう意味ではマーカーを指標にしてもある程度状況が判断できるかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.6648-18 - 2018/02/07 (水) 13:54:53 - おお >あと低分子蛋白にはNitrocelluloseがベターとか言う研究者の記事をネットで読んだりしてからこれらの蛋白の検出に0.45um Nitrocelluloseを使い出しました。すると低分子蛋白でも問題なくバンドをだせるようになりました。これって抗体との相性とかなんですかね ? 一概にどっちがいいと言えないと思いますが、PVDFのほうが吸着力、キャパシティーは高いと思っています。ただ、蛋白によってはイマイチだったのに膜を変えた以外条件を変えなかったのにうまく行ったりというのがよく扱うぐらいのサイズ（極端に大きくも小さくもない）でもあったりとか話を聞きます。蛋白の膜への付き方と抗体のエピトープ部位等によってどちらの膜がいいと決まることもあるのかもしれません。 ニトロセルロースで５kDaのある蛋白の断片も検出できていたので、小さい方は絶対PVDFがいいとかまでは言いにくいですが一般論では低分子などつきにくいと予想されるものはPVDFを使うといいというのが一般論かと思っています。 私は小さいものの取りこぼしを防ぐなら特にニトロセルロースなら０．２umを使うでしょう（ふだんから０．２umなんだけど）。また高吸着用に０．１umニトロセルロース膜も売られています。

(無題) 削除/引用 No.6648-17 - 2018/02/07 (水) 11:14:06 - おお >>上の方、大体上から三分の一あたりのところまでは、ほとんど検出されない >これの理由について何かご存知ですか、推察でもかまいませんが ? SDSPAGEでそれぐらいしか流れない場合その分子に対して、ゲルのポアが小さすぎるのでTransferの効率が悪くなると思いますが、それでも蛋白によって移動のしやすさはばらついているのだろうと。だからみんな残るわけではなくその中で効率がかなり悪くなったものがCBBで見えてるんだろうと。

(無題) 削除/引用 No.6648-16 - 2018/02/07 (水) 09:07:57 - pico ぉぉ様 >>上の方、大体上から三分の一あたりのところまでは、ほとんど検出されない これの理由について何かご存知ですか、推察でもかまいませんが ? >>ニトロセルロース膜を使ってたんですが、O/Nだと１５kDaの検出しようとする蛋白が抜けているようでした（PVDFを使ったら劇的に改善したので） ここは興味深いですね。実は自分は17kDの蛋白、10kDの蛋白をそれぞれO/N Wet, 0.45um PVDF, 1.5mm 12%ゲル、20%メタノールでずっとだそうとしてうまくいってませんでした。すると隣のラボの人が0.45um Nitrocelluloseで低分子量蛋白のバンドを問題なくだしてるのを聞きました。あと低分子蛋白にはNitrocelluloseがベターとか言う研究者の記事をネットで読んだりしてからこれらの蛋白の検出に0.45um Nitrocelluloseを使い出しました。すると低分子蛋白でも問題なくバンドをだせるようになりました。これって抗体との相性とかなんですかね ? あとこれは自分の中ではかなり確信をもった考えなんですが、特定の分子量マーカーがきれいに転写されることと、同じくらいの分子量を持つ目的の蛋白がしっかりとメンブレンに転写されること(要は最終的にいいバンドを得られる)とは必ずしもイコールではないということです。その根拠の一つ目は、以前140kDくらいの蛋白をSDS有りと無しのトランスファーバッファーで流して(他の条件は同じにして)比較したところ(おそらく大半のマーカーがメンブレンを通りすぎて)メンブレン上にマーカーが薄くしか残ってないSDSありの条件ほうがより太いクリアーなバンドが得られた経験があること。そしてもうひとつの根拠は最近10kDの蛋白を30V数時間のトランスファー(事情により数時間で引きあげざるを得なかったんです)と30V 16時間のトランスファーで比較したんですが、前者・後者ともに10kDのマーカーはメンブレン上に綺麗に転写されてました。ところが後者のほうがあきらかにバンドのでかたがいいんです。面白いことに30V数時間のトランスファーでも別の26kDの蛋白はものの見事に転写されていて非常にクリアーなバンドを得ることができました。

(無題) 削除/引用 No.6648-15 - 2018/02/07 (水) 08:22:13 - おお >３００kDaの領域がしっかりついてくれればそれでいいならどれでも支障はないと思います。 ３００kDaに最適化した場合という話です。 --- ちょっと経験をせいりして書いておきます。 昔はセミドライ派でした。教わったのがそうなので。Towbin buffer contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3, 20% methanolでやってましたが、一時間のTransferで条件は忘れましたが、電流で２００mA流れるくらいで１時間で十分大抵のものがみれました。ゲルの厚さは０．７５でした。１００kDa以上のものもありました。 まあそうしているうちに、Transfer後ゲルをCBBなどで染めてみたりとやったのですが、上の方、大体上から三分の一あたりのところまでは、ほとんど検出されないにしろ数本バンドが見られるというのに気が付きました。なのでセミドライでやるときは目的の蛋白を上から三分の一以上進むゲル濃度にして他の条件は変えないというふうにしばらくしていました。結局興味本位でバッファーを変えたりとかはしたこともありますが、基本ゲルの濃度で調整していました。 ある研究で４００kDaぐらいのものを扱うようになったのでこれは流石にやる前からちょっとびびったというか慎重にという意識が働いたのもあり、メタノールを下げたりというのを導入したと思います。あれこれやりましたけど全然バンドが検出されないということはなく、どれがベストとは言い難い状況でしたが。 まあ、そんなこんなでWETの道具しかないラボにも行きましたが、蛋白を上から三分の一以上進むゲル濃度にしてというところは意識するようにしていました。たいてい６０から９０分でTransferしてましたので。Towbin buffer contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3, 20% methanolをつかってました。 ある日O/N TransferをWET、Towbin buffer 20% methanol（SDSはなし）でやってみたのですが、ゲルが１２％、厚さ１．５mmとかでも２５０kDaマーカーはちゃんとうつるし、Transfer後のゲルを染めても全くバンドが検出されないしこれだとほとんど細工する必要がないなと感じ、あまり細かいことは考えなくなりました。ただし、ニトロセルロース膜を使ってたんですが、O/Nだと１５kDaの検出しようとする蛋白が抜けているようでした（PVDFを使ったら劇的に改善したので）。 WETならいずれにせよゲルの濃度は考慮したほうがいいでしょうけど、O/Nなら多少でかいからといってイジる必要もないなというのが個人的な感触です。

(無題) 削除/引用 No.6648-14 - 2018/02/06 (火) 20:42:02 - あかね うーん、このやり取り、すごく勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.6648-13 - 2018/02/06 (火) 10:30:18 - おお ３００kDaの領域がしっかりついてくれればそれでいいならどれでも支障はないと思います。 リプローブとかでもっと下のサイズも見る可能性があるなら、PVDFにして取りこぼしを少なくするというのも一つの考えと思います。

(無題) 削除/引用 No.6648-12 - 2018/02/05 (月) 23:22:29 - pico いろいろ考えましたが、SDSをいれると蛋白の移動速度は改善するかもしれないけど、メンブレンへの吸着がどうしても低下してしまうので、5 or 10% メタノール、6%ゲル、SDSなし あたりが最初にトライするのには一番無難な選択なのかなと。これでバンドがでなければおそらく蛋白がメンブレンまで移動できてないということなので、そときはBjerrumのバッファーを使ったりSDSを低濃度で加える。 あとメンブレンの選択については皆さんどうお考えですか。 理論上どれがいいとかありますかね ? PVDF vs ニトロセルロース 0.45um vs 0.2 um

(無題) 削除/引用 No.6648-11 - 2018/02/05 (月) 23:04:32 - pico ぉぉ様 詳細なアドバイス大変助かります。 Bjerrumのバッファーは予測される蛋白の等電点がトランスファーバッファのpHよりはるかに高い時に使った経験があります。確かに理論的にはどの蛋白も効率的にトランスファーできそうですね。 pろいkじゅhygtfrでw様 20%メタノールだとゲルが縮んで高分子蛋白は出てこれなくなる、あるいはSDSが剥がれて析出するという固定したイメージを持ってたんですがSDSを入れるとそうでもないんですね。何ボルト、何分ほど流されていますか ? 時間に余裕がないのは〆切間近というよりは、ボスの度重なるプレッシャーがすごいのと他にもする事が山のようにあるというのがおもな理由です。

(無題) 削除/引用 No.6648-10 - 2018/02/05 (月) 22:47:01 - pろいkじゅhygtfrでw 普通のTris-Glycine buffer (0.01~0.02%SDS＋、20%MeOH＋),wet式、冷却剤入れて室温でやってます。250KDaのマ―カー写ります。蛋白質染色すると一番上まで蛋白質バンド染まります。で、量が少なくてwhole cell lysateだと見えなくて、それを転写の問題かどうかと混乱すると時間がもったいないので、おおざっぱに核とPNS画分で構わないので分画してそれぞれwesternしたほうがいいかもしれないです。ki67だと核画分か？ リビジョンは編集部にちゃんとした理由を言って頼めば〆切を延ばしてくれるとおもうので、時間かかりそうなら〆切の少し前に連絡しておいたほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.6648-9 - 2018/02/05 (月) 20:27:45 - おお ２００kDaぐらいの糖蛋白でRunning bufferを使っているひとがいました。一時間ぐらいでトランスファーしてたかな、１００Vぐらいで。SDSは入れていたのかは覚えていません。膜はPVDFだったと思います。

(無題) 削除/引用 No.6648-8 - 2018/02/05 (月) 20:23:06 - おお 条件検討の火に油を注ぐようなことをしているかもしれませんが、Transfer bufferはアルカリに振ったほうが理論的に有利で実際にそういうバッファーがあります。SDSをいじるよりはこっちを検討したほうがいいような気がします。 Bjerrum Schafer-Nielsen buffer (48 mM Tris, 39 mM glycine, pH 9.2, 20% methanol) CAPS-based transfer buffer (10 mM CAPS, pH 11, 10% methanol) may be preferable for transfers of high molecular weight proteins (for example, >150 kD) Dunn Carbonate Buffer carbonate buffer (10 mM NaHCO3, 3mM Na2CO3, pH 9.9, 20% methanol) 最後のやつはトランスファーしているとどうやら炭酸の泡が出てきたみたいで気持ち悪いのでやめた。なんか間違えていたんかもしれんけど。 Bjerrum Schafer-Nielsen bufferはセミドライで一時よく使ってましたが、普通のWBでは通常のバッファーでも遜色がないので特別にこれを作るという作業をやめてしまった。Wetでも使えると思います。 http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/types-western-blot-transfer-buffers

(無題) 削除/引用 No.6648-7 - 2018/02/05 (月) 19:17:09 - おお 実際の経験を書いておくと、４００kDaのたんぱくを６％Gelでメタノール５％、セミドライで７５分TrisGlycine pH８．３、SDSはなし。ゲルの厚さは0.７５mmで十分トランスファーされました。膜はニトロセルロースでした。

(無題) 削除/引用 No.6648-6 - 2018/02/05 (月) 19:07:20 - おお 条件検討でハマりたくないと言いながら、いきなりかなり極端な条件で自らハマりに行っているような感じがするのですが、、、 私がまずやることはゲル濃度の選択です。なので ＞140kDくらいの蛋白をやってた時に10%メタノール (8%GEL, Wet30V　overnight, 0.45um PVDF)であまりバンドがぱっとしなかったので0.05% SDSを加えてやったらバンドが劇的によくなった その経験を活かすならゲルの濃度をさげて他の条件を変えません。 わたしはSDSはよほどのことがないと入れませんが、入れるとするならば0.01%までです。高いと膜への蛋白の結合も阻害されるので何やっているかわからなくなりますから。どうしても上げるならメタノールを２０％で下げないか、場合によっては２０％より濃くするかもしれません。SDSで調整するならメタノールをなるだけいじらないということです。 Running bufferでやるならSDSPAGEと同じように流れるわけですから、SDSPAGEで１００Vで２時間（１２０分）の泳動で１cmほどゲルの中を進んだとすれば、トランスファーでは２mmほど移動してくれればいいので２４分（１２０x２÷１０）のトランスファーで十分です。とくにSDSを入れているなら吸着せずにどんどん膜から流れ出ていくでしょうから、止めるタイミングが重要だと思います。SDSなしでも同じように考えます。実際いらないと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.6648-5 - 2018/02/05 (月) 18:28:35 - pico ぉぉ様、PD様 アドバイスありがとうございます。 PD様 具体的な条件を教えていただいて非常に参考になります。 Gelは何%を使用されていますか ? あとOvernightトランスファー(20-30V)を試されたことはございますか? そちらのほうが短時間でやるよりいいとおっしゃる方もいるようなので。

(無題) 削除/引用 No.6648-4 - 2018/02/05 (月) 16:23:42 - PD 280kDaくらいのタンパクのWB(WET)をしていますが、 ・5% MeOH, 0.006% SDS, TrisGlycine Buffer ・PVDF0.45um ・100V on ice 1h で一応バンドがでます。たまにあまり出ない時もあるのでもうちょっとSDS濃度をあげるなりした方がいいのかもしれませんが…

(無題) 削除/引用 No.6648-3 - 2018/02/05 (月) 08:23:30 - pico 以前140kDくらいの蛋白をやってた時に10%メタノール (8%GEL, Wet30V　overnight, 0.45um PVDF)であまりバンドがぱっとしなかったので0.05% SDSを加えてやったらバンドが劇的によくなったことがあったんですが、その時分子量ラダー(Bio-Radのやつ)がとても薄くなっていました。今回300kD超の蛋白なので、Gelを6%にさげてメタノールを5%までにさげて更にSDSを0.1%にしてトライしてみました。すると分子量マーカーがほとんど見えなくなりました。ポンソー染色ではかろうじてわずかな蛋白が残っているようです。隣のラボの人は以前200kDくらいの蛋白をやってたときにRunning Buffer(メタノールフリー、0.1% SDS)を使ってトランスファーしたことがあるけど分子量マーカーが消えたことはないと言ってました。これって蛋白が素通りしているのでしょうか。どなたか詳しい人はいないでしょうか。

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