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(無題) 削除/引用 No.6645-19 - 2018/02/05 (月) 12:47:05 - mss ＞ライゲーション後も一部電気泳動して、ライゲーション前のlinearなバンドが消失（減少している）=ライゲーションが成功している事を確認していますか？ 実はライゲーション後の泳動は見たことがありません。 次回確認してみます。 ＞DH10Bのときはややカナマイシンの効きが悪い感覚があって、50ug/mlにしています。 貴重なご意見ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.6645-18 - 2018/02/05 (月) 11:06:30 - 寿司 DH10Bのときはややカナマイシンの効きが悪い感覚があって、50ug/mlにしています。

(無題) 削除/引用 No.6645-17 - 2018/02/04 (日) 16:48:26 - mon > inversePCR後に�U型制限酵素で処理し、ライゲーションを行っております。 ライゲーション後も一部電気泳動して、ライゲーション前のlinearなバンドが消失（減少している）=ライゲーションが成功している事を確認していますか？ 質の良いライブラリーの作製には、各操作ステップでの確認が重要です。

(無題) 削除/引用 No.6645-16 - 2018/02/04 (日) 14:11:41 - おお メカニズムはわかりませんが、普通のインサートをいれたライゲーションなどでConstructionするとき、ライゲーションがうまく行ってないとかどこか悪いところがあれば、見かけ上プラスミドが入ってない大腸菌が生えてきたりすることはまあまああります。もしかしたら耐性遺伝子の部分が大腸菌のゲノムに取り込まれて耐性になっているのかもしれません。 そんなに簡単に耐性遺伝子なしに膜の性質とかの変化で耐性になるもんではないと個人的に思っています。何もトランスフォーメーションしてない大腸菌を撒いた場合まず何も生えてきませんから。もし生えてくるならその大腸菌株に変なものがコンタミしているかもしれません。 なのでTransformationまでの過程でなにかうまく行っていないところがあると疑ったほうがいいでしょう。場合によっては入れたインサートが大腸菌に悪さしている可能性も疑うべきです。

(無題) 削除/引用 No.6645-15 - 2018/02/04 (日) 13:47:27 - mss AP様、mon様 アドバイスありがとうございます。 詳しい説明は省かせていただきますが inversePCR後に�U型制限酵素で処理し、ライゲーションを行っております。 ＞10^5-6程度なら9cm dish寒天培地を10-20枚程度？使うのは現実的ですよ（コロニーを単離するのは無理なくらいですが）。20cm角程度のplateなら１枚で済みますし。 このあたりの操作に不慣れだったのですが、そのようなスケールは現実的なのですね。 非常に参考になります。ありがとうございます。

(削除できなかったので修正文です） 削除/引用 No.6645-14 - 2018/02/04 (日) 12:49:30 - mon inverse PCRで変異を導入し、線状DNAのままTransformation操作を行い、大腸菌内で環状化されるのを期待しているだと想定します。 環状化に必要な相補的な領域の長さが足りない等の理由で、線状DNAのまま大腸菌ゲノムに挿入されているのではないでしょうか？ この場合、想定される形質転換体数より相当少なくなります(=ライブラリーの質も落ちる）が、その辺りは確認していますか。 具体的には、ライブラリーを作る際、Transformation操作後一部を寒天培地に蒔いて、コロニーを計数し、ライブラリー全体の形質転換体数を見積ります。 そのコロニー数は想定内でしょうか？ なお、ライブラリーを作る際には通常の変異導入操作より環状化に必要な相補的な領域を長めにして効率を上げた方がよいです。あるいは制限酵素処理>Self-Ligationで環状化を確実にするとか。 ※ライブラリーの大きさの関係上、液体培養を行わず全てコロニーにするのは現実的ではないのです。 と書いていますが、10^5-6程度なら9cm dish寒天培地を10-20枚程度？使うのは現実的ですよ（コロニーを単離するのは無理なくらいですが）。20cm角程度のplateなら１枚で済みますし。

(無題) 削除/引用 No.6645-13 - 2018/02/04 (日) 12:37:56 - mon inverse PCRで、線状DNAのままTransformation操作を行い、大腸菌内で環状化されるのを期待しているだと想定します。 環状化に必要な相補的な長さが足りない等の理由で、線状DNAのまま大腸菌ゲノムに挿入されているのではないでしょうか？ この場合、想定される形質転換体数より相当少なくなります(=ライブラリーの質も落ちる）が、その辺りは確認していますか。 ライブラリーを作る際には、Transformation操作後一部を寒天培地に蒔い、コロニーを計数し、ライブラリー全体の形質転換体数を見積りますが、その数は措定内でしょうか？ ※ライブラリーの大きさの関係上、液体培養を行わず全てコロニーにするのは現実的ではないのです。 と書いていますが、10^5-6程度なら9cm dish寒天培地を10-20枚程度？使うのは現実的ですよ（コロニーを単離するのは無理なくらいですが）。20cm角程度のplateなら１枚で済みますし。

(無題) 削除/引用 No.6645-12 - 2018/02/04 (日) 12:04:54 - AP inverse PCRで作ったプラスミドとのことなので、ベクター骨格になにか変な変異が入っているとか？ in vitroで環状化してから形質転換しているのでしょうか？ それとも線形のまま入れて菌体内での環状化をねらう方法でしょうか？ 後者で環状化しないままで薬剤耐性を与えた、ってことはあるかなあ？ ライブラリーってことは色々な変異をいれた雑多なベクターからなるということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6645-11 - 2018/02/03 (土) 23:21:03 - mss AP様 コントロールに使っているプラスミドにも同じタンパク質（point mutationが入っていないだけのもの）がコードしてあります。そちらでリークしてプラスミドが抜け落ちて...ということが影響していないようなので、やはり形質転換体が少ないことが主な要因のように思えるのです。 また、非形質転換体またはプラスミドの抜け落ちたものが増殖するということは、その時点ではカナマイシンは不活性化（リン酸化）されているということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6645-10 - 2018/02/03 (土) 21:55:37 - mss 中年様 ＞寒天培地に出たコロニーからミニプレップしてプラスミドが十分量回収できるかどうかをまずは確かめてみてはどうでしょうか。pET28はコピー数の低いpBR322系の複製起点を持っていますが、そのせいで収量は高くありません。それがオチってことはありませんか。 一応コントロールとして行ったプラスミドによる形質転換では問題なくミニプレできていたのでそちらは問題ないと思っています。 ＞また、ライブラリーはどういう性格のものでしょうか。さまざまな長さと配列をもったインサートを持つもの（cDNAライブラリーのように）でしょうか、同じ長さのインサートにpoint mutationを入れたようなものでしょうか。 こちらも説明不足でした。 ベクターを1周するようにPCRをかけた際にpoint mutationを入れたものなので同じ長さのライブラリーです。 ＞ご質問の内容とは外れますが、10^6オーダーのサイズのライブラリーなら、いきなり液培にしないでまずはプレートに蒔き出した方がクローンごとのバラつきが少なくなると思います。 そちら非常に気になるのですが、現在使用しているプレートが半径4cm?ほどで一度にまける個数は3000個ほどが最大だと思っていました。10^6ともなると巨大なプレートに一度にまくということでしょうか。またその際の培地用の容器は自前で用意されているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6645-9 - 2018/02/03 (土) 21:49:51 - AP いやいや、インサートが入っているのが発現したらそういうこともあると言ってるんです。

(無題) 削除/引用 No.6645-8 - 2018/02/03 (土) 21:42:22 - mss AP様 >PCRのデザインは？　インサートを挟んだベクター上にプライマーを設定しているだろうか？インサート上にのみプライマーをおいたのなら、ライゲーションプロダクトに入っている遊離のDNA断片を増やしているかもしれない。 PCRはベクターを一周させた後にライゲーションを行っているので、インサートが入っていないということは今回無視しています。 >ベクターはpET28で、宿主はNEB10β(DH10Bの派生株)を使用し そこが原因じゃないか？ DH10BはDH5alphaと同様、lacI^qを持たない宿主。IPTGを入れなくてもlacZが発現するでしょ。pETにもlacI^qは乗せてあったと思うけど、宿主が強力にlac Promoterを発現にかかるからベクターからleaky expressionが起こって産物が負荷になっている。結局、プラスミドが抜けた奴らばかりになるのではないか？ 宿主をJM109、XL1-BlueなどLacI^qの効きのいいやつにしたらどうだろう。 こちらも説明不足ですみません。コントロールとして同じDH10Bに、ライゲーション産物ではなくプラスミドを入れて培養したものからは問題なくプラスミドが得られています。 書きながら気づいたのですが、形質転換時のプラスミド濃度を減らしていって ミニプレした際の収量を見るというのも一つの手かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6645-7 - 2018/02/03 (土) 20:49:37 - 中年 寒天培地に出たコロニーからミニプレップしてプラスミドが十分量回収できるかどうかをまずは確かめてみてはどうでしょうか。pET28はコピー数の低いpBR322系の複製起点を持っていますが、そのせいで収量は高くありません。それがオチってことはありませんか。 また、ライブラリーはどういう性格のものでしょうか。さまざまな長さと配列をもったインサートを持つもの（cDNAライブラリーのように）でしょうか、同じ長さのインサートにpoint mutationを入れたようなものでしょうか。 ご質問の内容とは外れますが、10^6オーダーのサイズのライブラリーなら、いきなり液培にしないでまずはプレートに蒔き出した方がクローンごとのバラつきが少なくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.6645-6 - 2018/02/03 (土) 18:49:00 - AP >10個ほどのコロニーをコロニーPCRで見て、全て目的タンパク部分の大きさのDNAを得ています PCRのデザインは？　インサートを挟んだベクター上にプライマーを設定しているだろうか？インサート上にのみプライマーをおいたのなら、ライゲーションプロダクトに入っている遊離のDNA断片を増やしているかもしれない。 >ベクターはpET28で、宿主はNEB10β(DH10Bの派生株)を使用し そこが原因じゃないか？ DH10BはDH5alphaと同様、lacI^qを持たない宿主。IPTGを入れなくてもlacZが発現するでしょ。pETにもlacI^qは乗せてあったと思うけど、宿主が強力にlac Promoterを発現にかかるからベクターからleaky expressionが起こって産物が負荷になっている。結局、プラスミドが抜けた奴らばかりになるのではないか？ 宿主をJM109、XL1-BlueなどLacI^qの効きのいいやつにしたらどうだろう。 培養温度を下げてみる、グルコースを添加するなどもlac Proの発現抑制に効果があるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.6645-5 - 2018/02/03 (土) 18:01:33 - mss 申し訳ありません。いろいろと説明不足でした。 ＞バンドとは？ プラスミド自体が存在しないのか？　インサートがないという意味か？ ミニプレップしたものをアガロース電気泳動でみたところ、プラスミド自体が存在していません。 >プレート上のコロニーに目的遺伝子があることは確認済み。 How? 10個ほどのコロニーをコロニーPCRで見て、全て目的タンパク部分の大きさのDNAを得ています >オーバーナイトの培養の間に、他の細胞も馴化してしまったと考えています。 他の細胞とはなに？　非形質転換体ということ？ 非形質転換体のことです。 ＞カナマイシンは分泌性でもなく細胞自律的にしか効かないと思うので、どういう事をイメージしているのかわかりません。 ＞カナマイシンはタンパク質合成を止めるわけで、その状態で進行する耐性の獲得とはどんな機構だ？ 考えが浅いのかもしれませんが、 カナマイシン濃度が薄い場合、全ての非形質転換体がすぐ死ぬことはないはずです。その間に膜の形質転換体によるカナマイシンのリン酸化や、非形質転換体の膜の透過性の低下が起きているのではということです。 この考えが間違っていたとしても、実際に培養液からはプラスミドが得られないということがあったので、培養の過程で何か起きているのではと考えています。 ＞ベクターや宿主くらい書いたほうがよかろう。 ベクターはpET28で、宿主はNEB10β(DH10Bの派生株)を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.6645-4 - 2018/02/03 (土) 17:25:37 - AP カナマイシンはタンパク質合成を止めるわけで、その状態で進行する耐性の獲得とはどんな機構だ？

(無題) 削除/引用 No.6645-3 - 2018/02/03 (土) 16:58:00 - AP ベクターや宿主くらい書いたほうがよかろう。

(無題) 削除/引用 No.6645-2 - 2018/02/03 (土) 16:56:40 - AP >翌日濁った液体培地からミニプレしてもバンドが存在しないという問題が起きています。 バンドとは？ プラスミド自体が存在しないのか？　インサートがないという意味か？ >プレート上のコロニーに目的遺伝子があることは確認済み。 How? >オーバーナイトの培養の間に、他の細胞も馴化してしまったと考えています。 他の細胞とはなに？　非形質転換体ということ？ カナマイシンは分泌性でもなく細胞自律的にしか効かないと思うので、どういう事をイメージしているのかわかりません。

大腸菌培養で抗生物質耐性を持ってしまう（膜が硬くなる？） 削除/引用 No.6645-1 - 2018/02/03 (土) 14:46:45 - mss 遺伝子操作後、大腸菌に形質転換してライブラリーを作製しています。 抗生物質は30ug/mlのカナマイシンを用いています。 形質転換後に一部寒天培地にまいたものはセレクションできているのですが 翌日濁った液体培地からミニプレしてもバンドが存在しないという問題が起きています。 プレート上のコロニーに目的遺伝子があることは確認済み。 ミニプレのハンドリングに関してもコントロールを取っています。 この原因として 液体培養に持ち込む大腸菌の中で、目的遺伝子を持つ割合が少なく オーバーナイトの培養の間に、他の細胞も馴化してしまったと考えています。 対策としてはカナマイシン濃度を上げるくらいしか思いつきません。 ※ライブラリーの大きさの関係上、液体培養を行わず全てコロニーにするのは現実的ではないのです。 そこで他の解決方法や、そもそも他の原因が考えられるかたは教えていただきたいです。 また、抗生物質に対する馴化の要因として「薬剤の膜透過性の低下」とあるのですが、これを踏まえると培養時間はやはり短い方がいいのでしょうか。培養時間が長いと細胞の破砕がしづらくなるという話を聞いたこともあるので、そちらについても伺いたいです。

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