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(無題) 削除/引用 No.6640-12 - 2018/02/02 (金) 09:06:44 - おお そう言われてみて見てみると100 mM Tris-HClってたしかに高いですね。多分グルタチオンで酸性に触れるからそれなりのバッファー効果を必要と考えているんでしょうか。グルタチオンも高いとNiビーズには不向きらしいけど。 https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=a68d7edd-7939-42a8-8fc7-c8ebf6940755&lang=en こちらでは１００mMって上限だわ。 薄めるか透析してつけばそれで良しだけど。。。

(無題) 削除/引用 No.6640-11 - 2018/02/01 (木) 21:39:28 - mon Trisって濃いとNi-NTAカラムへの結合を阻害するような？

(無題) 削除/引用 No.6640-10 - 2018/02/01 (木) 17:33:59 - おお >１０〜５０mM Na2HPO4、 １０から５０mMと書いたつもりでした

(無題) 削除/引用 No.6640-9 - 2018/02/01 (木) 17:32:23 - おお >ニッケルビーズに２−３割ほどしか結合してくれません。 素通りのものもC末が削れていないという根拠がありますか？

(無題) 削除/引用 No.6640-8 - 2018/02/01 (木) 17:21:15 - おお Na2HPO4 を溶かしたらpH９ぐらいになるらしいから、 １０〜５０mM Na2HPO4、１３５mM NaClの溶液を作ればいいんじゃない。 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/255793?lang=en&region=US

(無題) 削除/引用 No.6640-7 - 2018/02/01 (木) 17:21:03 - AP どんな場合でもかならずタグがレジンに結合するというのは幻想です。 実験ごと、タンパク質ごとに違います。 いろいろ設計や条件を検討してつかなかったものを付くようにするのもいいけど、そんなところで時間をかけるよりか、収率が悪いぶんはスケールアップして克服するというのも見識です。 実験的には2-3割もついてくれるならいいほうじゃないでしょうか。４，５回繰り返せばロス分は埋め合わせられる。

助けて・・ 削除/引用 No.6640-6 - 2018/02/01 (木) 17:03:16 - 横からです。。助けて・・ 25 mMグルタチオン＋100 mM Tris-HCl＋150 mM塩, pH7.5で溶出したGST融合タンパク質溶液に、Niビーズを放り込んで2段階目の精製をしようとしてますが、ニッケルビーズに２−３割ほどしか結合してくれません。。ほぼ素通りしてしまっています。GSHビーズには結合してるんですが・・・。 可溶化はリゾチームと1% Tx100と超音波処理（１分連続して氷上でソニックして、十分冷やしてを10回繰り返しました。）です。すべて4度で行っています。 GSTで精製はされるものの、ニッケルビーズには結合しにくいんでしょうか。。。 6xヒスタグはC末直下に付けましたが、グリシンセリンリンカーをその間に持たせるなどすべきだったんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6640-5 - 2018/02/01 (木) 13:28:06 - AP PBSのバッファー成分はリン酸バッファーでしょ。 リン酸塩で作ることが多いから意識してないかもしれないけど、リン酸バッファーを構成する酸と塩基はリン酸とNaOH/KOHでしょ。pHを上げるのなら共役塩基のNaOH/KOHを使うのが常識的だよね。

(無題) 削除/引用 No.6640-4 - 2018/02/01 (木) 13:24:45 - AP じゃなきゃ、最初からpH 8-9を与える組成でPBSを作る。 X2HPO4とXH2PO4 (XはNaまたはK) のモル比を9.5:0.5〜10:0で、それくらいのpHをになるはず。

(無題) 削除/引用 No.6640-2 - 2018/02/01 (木) 13:16:10 - AP NaOHでいいじゃん。

PBSのpHをトリス以外であげる方法。pH8−9くらい。 削除/引用 No.6640-1 - 2018/02/01 (木) 13:13:04 - BSA トリス以外の塩基を使用して、PBSのpHを8-9くらいにあげたいのですが、何かいい方法ありませんでしょうか？ニッケルビーズで精製をしようとしており、トリスが使えないのと、PBS（pH7.5）では肝心のヒスタグタンパクがフロースルーにだいぶ残っているのでどうしたもんかと思いまして。

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