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(無題) 削除/引用 No.6611-16 - 2018/01/26 (金) 10:00:26 - おお >[Re:14] としあきさんは書きました : 、おおよそ220000〜240000のDPM1が出ました。 > > ＞＞あ様、おお様 > 試しにamylose resin を用いてアッセイを取ってみましたが、タンパクAの有無によらずDPM1が出てしまいました。 そうですか。ただBio-Gel HTよりはブロッキングや洗を工夫しやすいと思いますので、試行錯誤をしてみてはどうでしょうか。界面活性剤とか使えると思いますか？

(無題) 削除/引用 No.6611-15 - 2018/01/25 (木) 23:23:33 - あらい MBP fusionとなると、そもそも目的タンパク質Aがfoldしてない可能性も否定できませんね。 目的タンパク質Aは何kDaでしょうか？ MBP tagをプロテアーゼで切ってSECした際に単分散ピークになるのか気になるところです。 resinへの吸着が問題となるなら、一度脱塩SECでタンパク/非結合リガンドを分画した方がいいと思います。 例えばタンパク+Hot, タンパク+Hot+Hotの1000x濃度のColdで比較したときに、 差が出ないとそもそも活性なし＝変性している、という可能性が高くなります。 脱塩SECは自分でスピンカラムなどに脱塩resin詰めてもいいですし、 GEなどでプレパックも売っているのでそちらでもいいです。 活性があるとわかっているものならいいですが、 そうでないならSECで単分散性を確認するなりSEC binding assayをするなりした方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6611-14 - 2018/01/25 (木) 21:38:04 - としあき 返信が遅くなり申し訳ありません。 ＞＞Tracker 様 単純にゲル溶解物に[3H]-Dを規定濃度添加し、ウォッシュなどせずに測定すると、おおよそ220000〜240000のDPM1が出ました。 ＞＞あ様、おお様 試しにamylose resin を用いてアッセイを取ってみましたが、タンパクAの有無によらずDPM1が出てしまいました。 ＞＞mon 様 cold なリガンドD ([3H]-D の100000倍濃度)であらかじめゲルをマスクしてみましたが、ダメでした。。。

(無題) 削除/引用 No.6611-13 - 2018/01/24 (水) 11:10:12 - あ 他の方も言っているように、Bio-Gel HTを使うというのがあまり筋が良くない気がする。 リガンドの分子量、脂溶性、推定されるアフィニティなどの情報があったほうが、具体的なコメントが得られるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.6611-12 - 2018/01/24 (水) 05:02:30 - おお >maltose binding protein を融合しているものです。 それならamylose resinを使ったほうがすっきりしないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6611-11 - 2018/01/24 (水) 04:58:55 - おお Bio-Gel HTは別にそのタンパク質に特異的な結合をするわけでもないので、いわばイオン交換のクロマとのゲルにつけているのと一緒かもしれません。なので蛋白をつけないゲルにはリガンドが吸着するのはあっても不思議ではないと思います。 ブロッキングもそういう状況なので微妙な感じがしますが、どうなんでしょう、、、 蛋白をつける方とつけない方にブロッキングするとして、目的のタンパク質がブロッキング剤と置換されないかとか、 蛋白をつけない方だけをブロッキングというなら、ブロッキングというよりネガティブコントロールですし。BSAは脂質のキャリアーですよね。。。リガントによっては吸着しちゃうかもです。もしネガティブコントロールを置くならなんかその蛋白の変異体とかにしたいという気がします。いずれにしろ、ゲルはそういう蛋白で飽和されていないとリガンドがつく余地を残してしまいそうですので、そのへんの見極めもどうするのかなぁと。

(無題) 削除/引用 No.6611-10 - 2018/01/23 (火) 22:46:20 - Tracker カウントでいいので、その8000〜10000DPMくらいの値は投入したホットの全リガンド量の何%に相当しますか？ あと、リガンドが低分子なのかペプチドなのか、とかタンパク質のサイズやタグの有無なども出せる範囲で情報があればもっと具体的な改善策をいただけると思います。

(無題) 削除/引用 No.6611-9 - 2018/01/23 (火) 21:47:51 - としあき ＞＞ mon 様 貴重なコメントありがとうございます。 無標識のDでゲルをマスクするというのは思いつきませんでした。明日試してみようと思います！ ＞＞ qq 様 度々ご返信していただきお手数おかけしております。 ご指摘いただいていますように、EDTAは１ｍMです。 Wash液を強くするというのは、pH の検討をするということでしょうか？なお、本リコンビナントタンパク質はmaltose binding protein を融合しているものです。

(無題) 削除/引用 No.6611-8 - 2018/01/23 (火) 21:17:25 - qq ＞一方[3H]-D が入っている条件では、すべての条件において放射活性 ＞が検出され、DPM１がおおよそ8000〜10000で差が無いという結果でした。 BioGelHTにリガンドが直接吸着するということですよね。組み換えタンパク質が結合能を失っている可能性も否定できませんが、それはあとで考えましょうね。 今更かもしれませんが、BF分離の方法を変更するのが良いのではないでしょうか？ １）まずはwash液の条件を強くする。結合している遊離の[3H]Dを洗い出す。KCｌはヒドロキシアパタイトに特別な役割があったようですが、どうなのでしょう？あと、EDTA１Mは1mMの間違いですかね？EDTAやEGTAをヒドロキシアパタイトに加える選択肢ってあるのか？（私は知らない） ２）BioGelHT以外の分離手段を用いる。ゲルろ過とか、大腸菌から組み換えタンパク質だとのことですから、なにかタグがついていつのではないでしょうか？GST-fusionだったり、His-tagであれば、そのままリガンド結合を測定できないかなあ？

(無題) 削除/引用 No.6611-7 - 2018/01/23 (火) 21:03:03 - mon BSAより低分子のカゼイン等はブロッキングに使えるかな??

(無題) 削除/引用 No.6611-6 - 2018/01/23 (火) 21:01:40 - mon つまり、Bio-Gel HTに[3H]-Dが非特異的に吸着する、と言うことなので、 (1)Bio-Gel HTに[3H]-Dが非特異的に吸着しない条件を探す。 (2)Bio-Gel HTに[3H]-Dが非特異的に吸着しないように前処理をしておく=ブロッキング ブロッキングとしては、無標識Dで飽和させておくか（不可能かもしれない）、別の物質(BSAは効かないようですね）で結合部位をマスクしておくか、でしょう。 Dとタンパク質Aの結合が強固（無標識Dと置換しない）なら、Bio-Gel HTを添加するときに多量の無標識Dを加えることでも良いかも。。

(無題) 削除/引用 No.6611-5 - 2018/01/23 (火) 20:52:07 - としあき >>qq 様 コメントありがとうございます。 ご示唆いただいた内容につきまして、やってみた結果があります。 リコンビナントタンパク（有り/無し）× 大量の標識されていないD（有り/無し）× [3H]-D（有り/無し）＝８通り について測定したところ、リコンビナントタンパク単独・標識されていないD単独ではいずれも放射活性は検出されませんでした。 一方[3H]-D が入っている条件では、すべての条件において放射活性が検出され、DPM１がおおよそ8000〜10000で差が無いという結果でした。

(無題) 削除/引用 No.6611-4 - 2018/01/23 (火) 18:25:18 - qq １）3HのついていないDを1000倍入れると、カウントがなくなるとか残るとか、 ２）リコンビナントタンパク質を入れないでBioGelHPと混ぜると、カウントが何故かあるとか、 そんなちょっと馬鹿げたような条件を調べる必要があります。

(無題) 削除/引用 No.6611-3 - 2018/01/23 (火) 12:32:11 - としあき >>火星の人　様 ご返信ありがとうございます。 ブロッキングというのは初めてお聞きしました。こちらの情報不足で申し訳ありません。当実験ではwhole cell でのリガンド結合実験ではなく、大腸菌から精製したリコンビナントタンパク質を用いております。これについてもブロッキング操作があるのでしょうか？ なお、バッファーの組成ですが、 ・binding buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4、800 mM NaCl、10% glycerol、1 mg/ml BSA、2 mM DTT) ・wash buffer (40 mM Tris-HCl pH 7.4、100 mM KCl、1 M EDTA、1 mM EGTA) を用いております。

(無題) 削除/引用 No.6611-2 - 2018/01/23 (火) 12:04:23 - 火星の人 ブロッキングはされておられますか？ バッファーの組成（イオン強度など）も公開されるといいと思います。

リガンドータンパク質結合アッセイ 削除/引用 No.6611-1 - 2018/01/23 (火) 11:18:34 - としあき お世話になっております。 [3H]標識したリガンドDとタンパク質Aの結合を測定する実験で難儀しており、皆様のお力をお借りできればと思いトピックを作らせていただきました。 現在条件検討のステップでありまして、タンパクAの有無に関係なく、[3H]-Dが検出されてしまうという問題が解決できません。 ゲルに[3H]-Dが結合してしまうのでしょうか・・・？ プロトコールは以下の通りです。 ・D、A、バッファーを混ぜ3時間4℃インキュベート（DとAの結合） ↓ ・Bio-Gel HTを加え、タンパクAを吸着させる(15分インキュベート、5分おきにボルテックス) ↓ ・5000rpm、1min で遠心、sup を除去して浮遊[3H]-Dを除去（×３） ↓ ・沈殿物(BioGel に付着したタンパク質A)をAtomlight で溶解し、液体シンチレーションカウンターで測定

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