いつも勉強させていただいています。
私は白血病細胞のセルラインを用い、細胞内のシグナルや細胞骨格の変化を研究しているものです。
この度細胞内骨格を染色するにあたり、浮遊細胞であるHL60を染色する必要があります。
サイトスピンがありませんので、ここのサイトを参考にし、浮遊状態で免疫染色を行なったのち、最後にスライドに封入しようと考えています。
初めにHL60を培養フラスコからエッペンチューブに必要量移し、500gで遠心する。
その後、上清を捨て、4％PFAで20分固定し、1000gほどで遠心する。
PBSを加え、遠心を繰り返したのち、1％BSA+0.1％TritonX100を含むブロッキングバッファーにてブロッキングを行なったのち、一次抗体、二次抗体を反応させました。
2点お聞きしたいことがあります。
一つ目は、PFAで固定したことが原因だと思いますが、遠心して洗浄する際、どんどんペレットの大きさが小さくなっていっています。1000gでは不十分でしょうか？1250gまであげたのですが、変わらずでした。皆様はどれだけのgをかけておられますか？
二つ目は、どのようにスライドグラスに封入させるか悩んでいます。
スライドグラスに洗浄済みの細胞懸濁液を10マイクロリットルほど乗せ、そこへ同じ量ほどのマウンティングリージェントを加えてよく混ぜたら封入という流れで大丈夫でしょうか？
大変初歩的な内容で恐縮ですが、よろしくお願いします。 |
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