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(無題) 削除/引用 No.6593-15 - 2018/01/23 (火) 15:32:01 - 弘法 5FOAのプレートがヘタっていたか何かなのかもしれませんね。そういう経験は無いんですけど。ともかくも当たりがあったようで良かったですね。 念のためにSC-Uraのプレートにもストリークして、Ura-になっていることをそちらからも確認しておくことをお勧めします。また、複数の当たり株が欲しければ、それが早道かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6593-14 - 2018/01/23 (火) 13:08:39 - ffoa やはり巨大コロニーのストリークは単に持ち込みの細胞が多かっただけだったのか、実は他のストリークからもコロニーが現れていました。 その、遅れて生えてきた“中サイズ”由来のコロニーも含め、ピックしてYPD培養→Genomic DNA抽出から、対象遺伝子＋Ura3のプライマーセットでPCRチェックした結果、なんと、その中サイズ由来の方の1クローンのみ、Ura3が落ちていました！ （巨大コロニーの方は、普通にバンドが増えました。何だったんですかね、これ） もちろん「PCRで増えなかった」というかなり半端な判定法なのでまだ確定ではありませんが、PCRは完璧な差だったので、恐らく当たりではないかと思っています。 もちろん、この後ーUraでの生育チェックも行ってみようと思います。 何とか、目的の株が得られたようで本当に安心しました。 弘法さん、何度もお世話になりました。また何かあったら追記で質問あるいはアップデートさせていただくかもしれません。 ひとまずどうもありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.6593-13 - 2018/01/21 (日) 15:26:47 - ffoa まだちょっと分かんないですけど、実はコロニーをピックする時に＋DNAで形質転換させたサンプルの方に、1つだけ他より明らかに大きい巨大コロニーがあるのに気付きました。 それを含む他の大きな（今となっては中サイズでしょうか）コロニーを複数、5FOAプレートへ再度シングルコロニーアイソレーションした結果、巨大コロニーからのみコロニーが生えてきました。 それでもまだ小さいので、持込みの細胞量が巨大コロニーだけ多かったから、という可能性もありますが、ほぼ間違いなくこれが当たりかと予想しています。 アドバイスがなければ気付かずじまいだった可能性もあるので、本当に感謝しきりです。 追って検証結果もアップデートさせていただこうと思います。ひとまずどうもありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.6593-12 - 2018/01/20 (土) 06:47:25 - ffoa 5FOAプレートは、完全にYeast Geneticsの成書に従っています。 見直したら、drop out mix -uraに、前述の濃度のウラシルをくわえているので、Final 50 ug/mLですね。 ただ、ウラシルのストック溶液が、遠い昔に学生が作ったようなやつなので、ひょっとすると濃度が正確ではない可能性があります。 次回作製時は横着せず、自分でストック溶液から作ろうかと思います。 50 ug/mLよりも低い方が選択圧が強くなるとかありますか…？ 5FOAの濃度は、いたずらに上げても良くないだろうしもったいないのでそのままにしようと思いますが…。 ご丁寧に毎度本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6593-11 - 2018/01/19 (金) 21:14:51 - 弘法 あれ？ もしかしてお使いの5FOAプレートって、通常のSCのレシピにさらに50 ug/mLのウラシルを足していますか？ だとしたらウラシルが濃すぎて選択が上手く掛かっていないおそれがあります。 ura3-株を選択するので培地にウラシルが全く入っていないともちろん生えないのですが、ウラシルが多いとウラシル生合成系のフィードバック阻害でURA3の発現が抑えられるので選択が掛かりにくくなります。その両者のバランスがいつもより薄いウラシル濃度になっているわけです。

(無題) 削除/引用 No.6593-10 - 2018/01/19 (金) 13:33:48 - ffoa そうであるといいのですが、最大の気がかりは、ネガコン（DNAなしで形質転換）にも同じサイズの大きなコロニーが多数存在することです。 普通に考えると、KOしたつもりの形質転換プレートの大きなコロニーも、このネガコンと同じものなのではないか…という点が不安なわけですが、何はともあれシングルコロニーアイソレーションをしてみようと思います。 全然作用機序を理解せずに実験してるのがお恥ずかしい限りですが、ウラシルが濃すぎるとダメなのはそうだったんですね、全く知りませんでした。 5FOAプレートにはあえてウラシルを添加しているので、むしろないとダメなんだと思っていました（ウラシルが基点となる代謝経路が働けば最終的に毒性物質が生まれるので、十分量ある分には問題ないのでは、と…。そういえばそう考えると、5FOAプレートは殺菌性の効果があるのももっともですね）。 幸い遠心後、「プレートにはウラシルが添加されてるから、問題ないだろ」と、一番沢山あるSC-Uraで懸濁していました。ウラシル過剰問題は大丈夫そうかな、という気がしますが、そもそも水で十分かもしれませんね。 よく酵母は水でwashしますが、浸透圧で破裂したりしないのかいつも不思議なんですが、残存の塩でそんなことは杞憂に過ぎないの一言に尽きるのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6593-9 - 2018/01/19 (金) 13:14:59 - 弘法 大きなコロニーは当たりだと思います。ご自身で心配されているようにURA3+株が持ち込まれてPCRで増えちゃったのではないでしょうか。大きなコロニーを新たな5FOAプレートにストリークしなおして、生えてきたものは大丈夫だと思うのですが。 また、洗浄云々は5FOAプレートへのウラシルの持ち込みを気にしています。ウラシルの濃度が高いと、URA3は発現しないので5FOA選択が掛かりません。

(無題) 削除/引用 No.6593-8 - 2018/01/19 (金) 13:01:57 - ffoa ネガコンが、大き目のコロニーだけで数百、さらに小さいコロニーもびっしりという形です（Geneticinプレートのように、大小様々なコロニーが存在する、いわば「バックが大きいな」という印象のプレートです）。 形質転換体の方は、大きめのコロニーが100に届くかそこらぐらいでしょうか。「それなりに生えているな」という印象のプレートです。もちろん微小コロニーも結構存在します。 PCR産物での染色体置換ですが、PEG含有の形質転換バッファーで42度処理後、4時間ほど回復培養といいますかYPDで培養し、その後遠心、SC培地で懸濁したものをそのまま5FOAプレートにまいています。 遠心→ペレットを直まき、なので、洗浄と呼ぶべきステップは挟んでいない形ですね。残存のDNAを除く意図等で、洗浄した方がよかったりするんですかね…？ 必要あれば次回以降見直してみたいと思います。 重ね重ね情報本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6593-7 - 2018/01/19 (金) 12:23:03 - 弘法 > PCR産物を用いた形質転換で、染色体上のある遺伝子に「タグ＋Ura3」を挿入 > →SC-Uraプレートからシングルコロニーを拾い、成育後、PCR産物を用いた形質転換でUra3をKO > →5FOAプレートには、ネガコン（PCR産物なしで形質転換プロトコールを同時に実施）から大量のコロニーが認められた。形質転換体からは、ネガコンの半分〜1/3か1/4ぐらいの数のコロニーが認められた のところは、具体的にプレート当たりどのくらいの数コロニーが出てますか。コロニーのサイズはどのくらいでしょうか。また、形質転換後に酵母細胞を水か何かで洗浄して、それをそのままプレートに蒔き出されたのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6593-6 - 2018/01/19 (金) 11:58:57 - ffoa 弘法様、度々ありがとうございます。 とりとめなく無駄に長々と書いてしまいましたが、その通りで、−Uraプレートで生えてきたコロニーが、5FOAでも生えてくるというのがそもそもの疑問点でした。 シングルコロニーアイソレーションで問題は解決するというご助言ですが、改めて整理しますと、 PCR産物を用いた形質転換で、染色体上のある遺伝子に「タグ＋Ura3」を挿入 →SC-Uraプレートからシングルコロニーを拾い、成育後、PCR産物を用いた形質転換でUra3をKO →5FOAプレートには、ネガコン（PCR産物なしで形質転換プロトコールを同時に実施）から大量のコロニーが認められた。形質転換体からは、ネガコンの半分〜1/3か1/4ぐらいの数のコロニーが認められた …という状況なのですが、このような形でも形質転換体のUra3がKOされている可能性というか期待値は高いものなのでしょうか…？ 仮にネガコンのコロニーを改めて5FOAプレート上にシングルコロニーアイソレーションした場合、これは恐らく生えてこないであろうことが期待されるということですかね…？ せっかくのアドバイスなのでとにかくやってみようと思いますが、そもそもUra3をKOせずとも5FOA上でコロニーが生えてくるという状況の時点で、何かおかしいのではないかとも思えますが…。 ネガコンプレート、形質転換プレートの両者から、複数コロニーを5FOAプレート上へシングルコロニーアイソレーションしてみようと思います。 結果は追ってアップデートさせていただこうと思っております。

(無題) 削除/引用 No.6593-5 - 2018/01/19 (金) 11:42:38 - 弘法 株はUra-のプレートで生えるんですね？ならば私のコメントの後半は全て忘れてください。 5FOAの効果は殺菌的だと思います。でも、YPDの持ち込みなどがあって培地のUra濃度が高めだと、URA3+の株でも小さなコロニーを作ることはあるかもしれません。 プラスミドシャッフルが上手くいってるとのことなので、5FOA培地は使えるようですね。それでは、最初の5FOAプレートに生えてきたコロニーをそのまま使うのではなく、5FOAプレートに再度ストリークして生えてきたシングルコロニーを使えば問題は解決すると思います。

(無題) 削除/引用 No.6593-4 - 2018/01/19 (金) 05:49:29 - ffoa 弘法様 懇切丁寧なアドバイス、誠にありがとうございます。 5FOAは、Methods in Yeast Geneticsの通りの組成で行っています（ただし、横着して、5FOAはオートクレーブ後、ストック溶液を作るのではなく、粉末を直接培地に加えました。問題ないと思うのですが…）。 SC培地に、Final 0.1%の5FOAと、50 ug/mLのウラシルですね。 5FOAプレート自体は、実はUra+株でテストはしていないのですが、別のUra3プラスミドを落とす、いわゆるプラスミドシャッフリングの系では一応ワークすることは確認しています。 5FOAプレートに生えてきた株に関しては、最初の書き込みにもある通り、genomic DNAを抽出してPCRチェックした結果Ura3が落ちていないことからも分かる通り、Ura+のままであると思われます。 当初、YPDで培養後、ごくごく少量をSC-Uraに播種した結果、丸1日以上全く生育しなかったので成功したかと思いきや、2-3日経つと濁り始め、最終的に完全に濁りました。 持込みの細胞が非常に少なく、時間がかかっただけかな、と思っています（何も播種しないコントロールは透明のままであることは確認済み）。 シングルコロニーに関しては、実は追って質問させていただこうと思っていました。 特に5FOAプレートからピックする時は、非常に小さいコロニーをつついたため、バックグラウンドのUra+クローンもつついたのではないかと不安になっていました。 カナマイシン等の抗生物質と違い、バックにいるであろう見えない大量の細胞は、死んでいるわけではなく休んでいるだけで、ひとたび5FOAがなくなると活動し始めると考えていいように思っているのですが（違うかもしれませんが…）、いずれにせよシングルコロニーをつついたつもりが引けていない可能性はあります（もちろん一応、理想的には、シングルコロニーで全て始めています）。 使用している株はBY474x系なので、Ura3は完全に抜けていると認識しています。 タグの挿入は、現在タンパクレベルでチェックを行おうとしているところです。 遺伝子のタグ化・Ura3のKOの形質転換ともに、ゲル精製したPCR産物を用いているのですが、万が一ごく少量でもテンプレートとして用いたプラスミドが残存しており、それが残っていたら問題かもしれませんね。 …あれ、でも、プラスミドでUra3+を得ているのであれば、5FOAプレートでセレクションさえかかれば除けるように思うので、やはり5FOAでコロニーが生えてくること自体がおかしいようにも思いますが、色々な可能性がありすぎて何ともいえない状況かもしれません。 とりあえずタグが正しく挿入されているか、Westernでチェックしてみようかと思います。 何か気になる点ありましたら、追ってご指摘いただけると大変幸いに思います。 アドバイス、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6593-3 - 2018/01/18 (木) 14:04:43 - 弘法 すみません、最初のパラグラフのUra+はUra-の誤りです。

(無題) 削除/引用 No.6593-2 - 2018/01/18 (木) 14:03:23 - 弘法 いろんな可能性があるのでこの情報からだけではなんとも言えないのですが、まずは、5FOA選択はきちんと機能していますか。つまり、生えてきた株はUra+になっていることを確認していますか。5FOA培地の組成は大丈夫ですか。 それが大丈夫だとすると、全てのステップでシングルコロニーからスタートしていますか。タグが悪さをするような場合には抜けたものが蓄積しているかもしれません。 タグがきちんと挿入されていることは間違いないでしょうか。URA3がゲノムに挿入されずプラスミドのままだったり、株のura3座位にタンデムに挿入されていたりすると、高頻度でura3株に戻ります。PCRのチェックは見たい場所だけを見ていて、他で変なことが起こっていないことは見えませんよね。 そもそも、使った株はURA3マーカーに含まれている領域が全て抜けているものですか。そうでないとすると、ほとんどのUra+株はURA3座位に入ると思います。

酵母の5FOAセレクション 削除/引用 No.6593-1 - 2018/01/18 (木) 12:23:25 - ffoa 既にkanMXを染色体上に持っている酵母株のある遺伝子に、URA3マーカーでタグを挿入しました。 形質転換後、−Uraプレートで選択、その後genomic DNAを、対象遺伝子＆Ura3を認識するプライマーセットでPCRし、正しく挿入されていることを確認しました。 その後、挿入したUra3を削除したかったので、［対象遺伝子3'末端-タグ::(Ura3)::対象遺伝子3'UTR］というPCR産物を用いた形質転換で、Ura3のKOを試みました。 形質転換後5FOAプレートにまいたわけですが、なんと、ネガティブコントロール（PCR産物を加えずに形質転換）で大量のコロニーが生まれました。 PCR産物を加えた方もコロニーはありましたが、数はネガコンより遥かに少なかったです。 それはともかく、なぜ染色体上のUra3は栄養要求プレートで機能していたにもかかわらず、5FOAでこれだけ生えてきてしまったのでしょうか…？ ちなみに、KOしたつもりの方のポジティブサンプルからコロニーを複数ピックし、YPDで増殖させ、genomic DNAを抽出後上記と同様にPCRチェックしたら、（まぁネガコンで大量にコロニーがあるから当然かもしれませんが）どれもUra3はKOされていませんでした。 どなたか、どのステップに誤りがある可能性が高いのか、よくありがちな落とし穴がどこなのか、ご教示いただけますと大変助かります。 周りはあまり酵母について質問できる環境ではないので、ご助力いただけると幸いに思います。よろしくお願いいたします。

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