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ありがとうございました。 削除/引用 No.659-9 - 2012/06/27 (水) 20:18:54 - ビオ 皆様、いろいろとアドバイスいただき、ありがとうございました。 お礼が遅くなりまして、申し訳ありません。 プライマーは、確かに凍結融解はかなり繰り返していましたし、 へたってしまった可能性がありますので、 新しく注文することも検討しようと思います。 ただ、以前にRNA抽出→RT反応をかけてストックしておいたcDNAは、 うまくPCRがかかりました。 （２サンプルだけしか確認していませんが） しかし、今回のサンプルでもかかるものも割合的には低いですが、 存在するので、たまたまうまくいったのかもしれません。 RNA抽出→RT反応の操作法がまずいのかなとも思ったのですが、 同様に行った別プライマーで確認するサンプルは すべて綺麗にPCRはかかっていたので、 やはりプライマーが原因なのかなーとも思ったりします。 ウイルス液は、新しく調整したものですが、 CPEはいつものような感じでみえてきましたし、 大丈夫かと思ったのですが。。 まだ、確実な原因がわかりませんが、皆様の意見を参考にさせていただいて、解決できるように進めていきたいと思います。 改めて、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.659-8 - 2012/06/27 (水) 13:29:33 - 掲示板では双方伝わらない ここになかなか興味深い議論があります。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=627

(無題) 削除/引用 No.659-7 - 2012/06/25 (月) 13:53:07 - ~ そもそも、ウイルス液は実験が中断していた数ヶ月間にどのように保管されていたのでしょうか？ または、新しく調整されたのであれば、調整法自体が不安定であり、PCR部分には問題が無いのかもしれません。 １ウイルス液中のウイルスの分解 ２プライマーの変質 ３サーマルサイクラーの温度の変化（プログラムの変更または温度コントロールの故障） などが考えうると思いますが、コントロールの結果により否定できる部分はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.659-6 - 2012/06/25 (月) 07:19:51 - モモ ウイルスは無事なんですかね？

(無題) 削除/引用 No.659-5 - 2012/06/25 (月) 01:04:43 - カイ いや、サイエンティフィックな論理はともかくとして、経験的にあることですよ。 プライマーセットを混ぜて保存した場合、プライマーを室温や4度で長く置いた場合、凍結融解を繰り返した場合など。 前のトピックにもありました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;start=3;Code=511 前のトピックを調べてから質問したほうが望ましいかもしれませんが、これくらいは答えてもいいような気がしたので、回答しました。 買いなおすまではしなくても、プライマーの濃いストック溶液持ってませんか？そこから薄め直して、試してみるのは手ですよ。 おせっかいついでに、同じサンプルで異なるプライマー、同じプライマーで異なるサンプルなどで比べないと、サンプルが悪いのかプライマーが悪いのか、酵素なのか、判断しかねます。ポジコンネガコンは常に置くように心がけてください。

(無題) 削除/引用 No.659-4 - 2012/06/24 (日) 23:59:25 - ami 根も葉もないことをつたえるのはどうかと。。

(無題) 削除/引用 No.659-3 - 2012/06/24 (日) 23:12:09 - 再注文数千円 プライマーがヘタってはいませんか？ 同じ配列の新しいプライマーでやり直したら出るかもしれません。 ヘタる=長期保存、凍結融解でプライマーが末端から削れて行く感じ。

(無題) 削除/引用 No.659-2 - 2012/06/24 (日) 17:12:14 - ami つhttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=627

RT-PCR　非特異サイズのバンドしか出なくなりました 削除/引用 No.659-1 - 2012/06/24 (日) 16:54:45 - ビオ バイオ系初心者ですが、お邪魔致します。 現在、ある細胞にウイルスを感染させて、CPE確認後にハーベストしたウイルス液から、RNA抽出、RT-PCRを行っているのですが、 数か月前までは比較的うまくいっていたのに、今月再開したところ、 ３，４割の可能性でしかうまくいかなくなってしまいました。 具体的には、目的サイズが2kbp弱ですが、最近は数百bpのサイズのバンドが濃く出てきてしまいます。 元々、全長サイズをとるために設計されたというプライマーを用いているので、 PCRがうまくいってもメインの2kbp弱と共に、それ以下の複数のバンドが薄く見られます。 しかし、最近は、メインのが見えず、小さいサイズのが濃く見え、それもサンプルによってサイズの異なるものが濃く出ている感じです。 他の種類のサンプルもやっているのですが、そちらは100％の確率でPCRはちゃんとかかっています。 ただし、プライマーが特異的なもののため、PCRの条件的にやりやすいものなのかもしれません。 今問題のものは、条件的に厳しいので、上手くいくかいかないか、ぎりぎりなところなのかなーという気もします。 （数か月前も、やり直しして出るということもあったもので・・。ただ、今はやり直しても、出ないものは出ないことが多いんです。。） そこで、現在用いているTOYOBOのrTaqをKOD FXに変えてみようかなと思うのですが、酵素を変えれば解決するわけではないかもしれませんし、 なにせ、この分野が専門ではないので、皆様のアドバイスをお聞きしたいです。 宜しくお願いいたします。

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