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(無題) 削除/引用 No.6585-6 - 2018/01/18 (木) 17:47:36 - TK 目的がCRISPRによるノックダウンのようですが、lentiで細胞にウィルスがはいったとしても、うまくノックダウンが起こったcloneをとる必要があると思います。primaryですとsingle cell cultureからのcloneの樹立が難しいと思うのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.6585-5 - 2018/01/16 (火) 12:54:10 - MP レンチだと大抵VSV-Gを使っているはずなので、retronectinはあまり効かない可能性が高いです（メーカーはVSV-Gでも効率upと謳ってはいますが、、、）。それより、単純にウイルスtiterが充分ではないのでは？ウイルスは第３世代ですか？もしそうなら第２世代の方がtiterは１オーダーくらい高いのでそちらを使うか、あるいは超遠心等での濃縮を試すとか。あるいは感染はしているけれどナイーブTでのプロモーター活性化が弱いので、発現が見えてないだけの可能性もある。

(無題) 削除/引用 No.6585-4 - 2018/01/16 (火) 09:59:31 - mon TAKARAに問い合わせるのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.6585-3 - 2018/01/15 (月) 21:54:25 - nekokoneko mon様 ありがとうございます！私もRetroNectin調べました！ ただ結合に必要なVLA-4や5というものがT細胞では発現が低いようで、、、難しいのかなと思ってトライしていません(>_<)

(無題) 削除/引用 No.6585-2 - 2018/01/15 (月) 20:35:24 - mon 経験はありませんが、RetroNectinが良いかも。。 ttp://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100002954

primary T細胞にlentiベクターで配列を入れたいのですが... 削除/引用 No.6585-1 - 2018/01/15 (月) 13:53:08 - nekokoneko マウスのprimaryのT細胞にCRISPRのガイドRNAを入れて遺伝子をノックアウトしたいと思い、lenti-vectorを用いてinfectionさせようとしていますが、全然入りません。 その後の解析の関係から、T細胞を無刺激のままに使いたいのですが、論文を見るとlentiでも刺激をしているものが多く...やはり難しいのでしょうか。 ちなみにinfection時にDOTAPを加え、plateを遠心してから37℃でインキュベートしています。 コツなどありましたら是非教えていただきたいです。 どうぞよろしくお願いします。

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