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(無題) 削除/引用 No.6581-6 - 2018/01/16 (火) 19:26:51 - AP PCRでgenotypingする程度の目的ならコロニーPCRの要領で、精製しなくてもいいくらいだし、定量も260/280 Ratioなんかも必要ない。多検体をあつかうことが多いthrough-putが重視されるべき実験なのになんでそんなことやってんの？と思ってしまう。 ひとつはみなさんのおっしゃるようにrobustなPCR系を選ぶこと。 DNAを粗抽出してやるなら、Chelex 100を使う方法をおすすめする。 サンプル体積のおおよそ5〜10 vol. の10% slurryを加え（96 wellなら50 uLも入れればいいだろう）、95℃-100℃で10 分、遠心か静置でレジンを沈めて上清を1 uL使ってPCR。PCRの阻害物質がよく取れてとてもPCRのかかりが良い。

(無題) 削除/引用 No.6581-5 - 2018/01/16 (火) 18:53:07 - ANO そのキットではアルコール沈殿のステップがありますか？ もしあるなら、ニッポンジーンのエタ沈メイトのような共沈物を添加しないと 思い通りに沈殿しないし、マイクロチューブ等への吸着ロスも起きます。

(無題) 削除/引用 No.6581-4 - 2018/01/15 (月) 00:45:45 - Tracker てーせるさんが推奨されているクルードサンプル向けの酵素を使うのがコスト的にもいいと思います。 KOD FX neoを使って96 wellスケールで100個も細胞いれば余裕でジェノタイピングできました。 やり方はいたって簡単でしたが、参考程度に書いておきます。 細胞をPBSとかで洗ったあとに50mM位のNaOHを20-30ul加えて細胞を溶かし、1M Tris-HCl pH7.6-8.0あたりを1/10量加えて中和します。 このクルードな細胞溶解液1ulをテンプレにしてPCR

(無題) 削除/引用 No.6581-3 - 2018/01/14 (日) 18:37:39 - おお 詳しい方法論は時間があるときにかけるかもしれないが、とりあえずコメントするとすると、キット使わないほうが確実じゃないかな

(無題) 削除/引用 No.6581-2 - 2018/01/14 (日) 17:17:51 - てーせる その位の量の細胞であれば、下手に抽出操作をせずに 細胞懸濁液をテンプレートにして直接PCRしたほうが良いのでは。 KOD FXやTks Gflex等クルードサンプル向けの酵素の使用を推奨します。

96 well に撒かれた接着細胞からの ゲノム DNA 抽出 削除/引用 No.6581-1 - 2018/01/14 (日) 14:07:45 - 少々 いつも参考にさせていただいています。 96well プレート上の接着細胞からゲノム DNA を抽出したいと考えています。 ウエルあたりの細胞数は 20000 個で、目的はジェノタイピングです。 96-well で細胞の剥離が難しくかつ少量のため、 微量サンプルから抽出できるとの触れ込みのキット（ヌクレオスピン）を使ってみましたが 抽出できた核酸量のばらつきが大きく、OD 260/280 もかなり酷いもので、ダウンストリームのPCRもうまくかかりませんでした。 ポジコンとして、臓器からの ゲノム DNA はしっかり抽出できており、一般的な量と質のサンプルを使えば、キットや手順には問題がないと判断しています。 そこで上記のような少量サンプルから DNA 取得方法について 工夫すべき点、使えるキットなどありましたら教えてください。

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