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(無題) 削除/引用 No.6579-4 - 2018/01/24 (水) 08:59:38 - DH5A トピ主です。 遅レスですみません。トラブルシューティングをしており、解決しそう？な気配を感じたので、漸くレスしたいと思います。まず初めに、返信が遅くなりすみませんでした。 結果からいいますと、cPCRで陽性のクローンをミニプレップした産物はインサートが入っていませんでした。 このことから、プラスミドは持っているがインサートを持たない。また、cPCRが陽性であることから、インサートはゲノムに挿入されたもの、と考えています。 そこからさらにいくつか条件検討しました。 結局、全く同じベクター、インサートを、自作の低塩LBで培養したところ、コロニーは通常の速度で大きくなり、cPCRで陽性のクローンをミニプレップし、制限酵素チェックしたところ、モノが切り出されました。 塩の濃度が決定打のようで非常にびっくりしました。 というのも、高塩だとゼオシンが効きにくくなる＝コロニーが増えやすくなると思っていましたので。 やはり指示書に従うべきだということを理解しました。 ちなみに使用したベクターはpFUSE-hIgG2-Fc2です。 シークエンスさえ良ければ次に進めそうです。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6579-3 - 2018/01/14 (日) 19:47:24 - まんせる Low salt LB とLBの差もあるのでは？ Zeocinの時にLB培地を使ったことないけど・・・

(無題) 削除/引用 No.6579-2 - 2018/01/14 (日) 13:06:25 - mon insertによるとは思いますが、high copy plasmidなら増殖はAmpと変わりません。 48時間も掛かったとすると、plasmid状態ではなくゲノムに挿入されているかもしれません。。miniprepで確認してください。

ZEOCINってゆっくりめですか？ 削除/引用 No.6579-1 - 2018/01/14 (日) 02:34:47 - DH5A 初めて質問します。宜しくお願いします。 100mg/mlゼオシンをインビトロジェンから購入し、それを適温のLBアガーに25ug/mlで加えました。 そこへ、形質転換後のDH5αをプレートして12時間後にはコロニーゼロでした。そのまま放置してさらに3時間後もゼロ。さらにそのまま放置して、結局48時間後くらいに大きな（直径2mm以上）のコロニーが生じていることに気付きました。先ほどコロニーPCRを行い、ものが入っていることが確認できました。 同時にアンピシリンで選択する別のDH5αも形質転換していましたが、12時間で目視可能なコロニーが生じていたことからゼオシンによる形質転換後の目視可能なコロニーの出現時間が遅いのかな？と考えていますが、どうでしょうか？一般的ですか？ ちなみにゼオシンは低塩のLB培地で行うべきですが、私は通常のLBアガープレートで作製しました。 これも理由の一つでしょうか？

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