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(無題) 削除/引用 No.6578-6 - 2018/01/13 (土) 23:28:33 - あqszdxcfgvbhjkんlm；。／ いまはIP適用可能な良い抗体も増えているので正攻法で内在性のものをIPした方がむしろ近道ということもある。科学的な説得力もtag蛋白質のそれよりもはるかにあるし、余計な不安要因が入りにくいし、突っ込まれることも少ない。 付けたflagが相互作用を直接あるいは間接的にじゃましてるのかもしれない。tagはtagはちっちゃいから問題ないとかそういうのは差したる根拠の無いうちらの勝手な理屈であって、実際のところ、そんなことあるの？みたいなことも起こりうるわけで。

(無題) 削除/引用 No.6578-5 - 2018/01/13 (土) 17:58:58 - mon FLAGタグの位置は適切ですか？ C末に付けると局在が変化するタンパクもありますし、タグの位置により相互作用が阻害されるタンパクもあります。

(無題) 削除/引用 No.6578-4 - 2018/01/13 (土) 17:25:46 - あqszdxcfgvbhjkんlm；。／ CaとかMgのような金属イオンとかNADみたいな補酵素とかATPとかADPとかそういった低分子物質がその相互作用に関わるという事は報告は無いですか？。もしそうならば、EDTA／EGTAいれてませんか？分子間相互作用が翻訳後修飾で調節されることがしばしばあります。もしリン酸化やアセチル化、SUMO化などの関与があるならば、阻害剤を使って、IP中に起こるかもしれない脱修飾にたいする対策は講じていますか。

(無題) 削除/引用 No.6578-3 - 2018/01/13 (土) 17:18:34 - mon 界面活性剤について、NP40とTrinton X100は分子構造が似ているので余り大きな改善はみられないと思います。 界面活性剤の選択は試行錯誤です。 ttp://www.labome.jp/method/Detergents-Triton-X-100-Tween-20-and-More.html n-ドデシル-β-D-マルトシド、オクチルマルトシド、ジギトニン、 MEGA-8、Tween20辺りがマイルドでしょうか。場合によっては（収率が低くなりますが）凍結・融解・遠心で上清をとっても良いと思います。 少量セットも入手可能です。 ttp://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/ByChuInfo/03 DSP等のクロスリンカーを使うのも手だとは思います。

(無題) 削除/引用 No.6578-2 - 2018/01/13 (土) 17:11:14 - おお CHAPSとかBrijとかか、、、前者はAnti-flag antibodyとの相性を確認する必要があるかも。Tweenとかでもいいかもしれないが、膜を可溶化する能力がかなりよわい。界面活性剤変えるのも手かもしれないが、１％TRITONでやってるなら、０．２％ぐらいに下げるとか。とにかく界面活性剤抜きで細胞を物理的に破砕して界面活性剤抜きでIPしてしまうという大胆なやり方も無きにしもあらずだとおもう。 クロスリンクIPというのも考えてみてもいいんじゃないかな。

免疫共沈降時のマイルドな細胞溶解液について。 削除/引用 No.6578-1 - 2018/01/13 (土) 15:45:10 - 棚橋 初歩的な質問で申し訳ないのですが、トピックを立てました。 現在、免疫共沈降実験を行なっているのですが、見たい結合が見れていません。 細胞溶解バッファーはCell Signaling Technologyの1x cell lysis bufferにタンパク質分解酵素阻害剤カクテルを加えたものです。 基本的には１% Triton X-100の入った137 mM NaCl入りのトリスベースのものです。 1% Triton X-100よりもマイルドな界面活性剤として、何かおすすめのものはありますでしょうか？ 沈降させたいものは、293T細胞の細胞質に局在するもので、FLAGタグ付きのものを過剰発現させ、anti-FLAGで免疫沈降させていますが、論文にあるようにあるタンパク質は一緒に落ちてきてくれませんでした。 3回行なって全てだめです。FLAGでのIP効率はほぼ100%です。 1%Triton X-100ではタンパク質複合体が壊れてしまうのでは？と思い、界面活性剤の変更を考えていますが、オススメのものはありますでしょうか？ 例えば、1% NP40 in 50 mM Tris, 137 mM NaClなどではどうか？などを考えていますが、根拠があるわけではありません。 大変初歩的な内容で恐縮ですが、コメントをいただけますと嬉しいです。よろしくお願いします。

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